一种污染胚胎的处理方法技术

本发明专利技术公开了一种污染胚胎的处理方法，该方法在发现胚胎被细菌污染后，立即对胚胎进行反复多次洗涤及更换培养液，削薄或去除胚胎透明带后继续培养至囊胚期，使用特殊胚胎体外培养方式等手段，获得了相对较好的培养效果和临床结局，患者在胚胎移植后成功妊娠，目前状态良好。良好。

【技术实现步骤摘要】
一种污染胚胎的处理方法


[0001]本专利技术涉及辅助生殖
，尤其涉及一种污染胚胎的处理方法。

技术介绍

[0002]辅助生殖技术是人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)的简称，指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精(Artificial Insemination，AI)和体外受精
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胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer，IVF
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ET)及其衍生技术两大类。试管婴儿就是使用该技术的体外受精—胚胎移植方法生育的婴儿。世界首例试管婴儿的诞生被誉为继心脏移植成功后20世纪医学界的又一奇迹，激发了全球许多国家研究这一高新技术的热潮。
[0003]在进行体外受精—胚胎移植周期中，为使配子和胚胎在体外能够良好的生长发育，体外受精(in vitro fertilization，IVF)实验室执行严格的质量控制与管理，包括实验室仪器设备、培养用耗材与培养液、技术人员、培养环境等，实验室程序和操作的每一步都必须以严格的无菌技术纪律进行。IVF
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ET过程中胚胎污染的来源大致为3个方面：精液、卵泡液和IVF培养系统及环境。虽然胚胎污染的发生率不高，但是，胚胎污染一旦发生将对整个取卵周期的结局造成很大的影响，导致卵子的退化，受精率低下、损伤胚胎的发育潜能、妊娠率和种植率低下，甚至污染可能扩大到整个实验室培养体系，目前，据报道国外胚胎污染率大约0.35％～0.69％，国内为0.51％
[0004]在胚胎发生污染时，目前常用的方法是使用含有抗生素的培养液充分洗涤，最大可能的去除胚胎表面的细菌。但是，由于胚胎透明带外表面是一种网状结构，这种结构在发生微生物污染时很容易使体积较小的细菌藏匿其中，因此，多数情况下在洗涤后仍会有细菌的生长。另外，使用细菌敏感的抗生素处理被污染的胚胎也是常用的方法之一，但是，这种方法首先需要进行细菌抗药性实验，要3
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5天才能出结果。而发生污染事件时需要马上进行处理，因此，在这种情况下，往往是随机选择一种抗生素进行处理，或者是先将胚胎进行冷冻保存，等细菌抗药性实验结果出来后再解冻处理。但是，胚胎在冷冻和解冻过程中会有冷冻损伤，严重时会发生退化，导致胚胎直接死亡，并且这项操作会增加患者经济负担。因此，在胚胎培养过程中发生污染时，需要一种及时有效方法进行处理，最大限度的保障患者的利益。目前尚未发现其他利用此方法处理污染后胚胎的研究。

技术实现思路

[0005]鉴于现有技术中存在的问题，我们开发了一种污染胚胎的处理方法，该方法可以在体外受精过程中对被细菌污染的胚胎进行挽救，成功率较高。利用此方法，已成功帮助一位胚胎污染患者获得了妊娠，目前状态良好。
[0006]一种污染胚胎的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S0：预平衡洗涤液的制备：将受精液或胚胎培养液在培养箱中平衡过夜，得预平衡洗涤液；
[0008]S1：预平衡胚胎培养液制备：将胚胎培养液在培养箱中平衡过夜，得预平衡胚胎培养液；
[0009]S2：预平衡酸性台氏液的制备：将酸性台氏液在37℃平衡15
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60min，得预平衡酸性台氏液；
[0010]S3：液滴制备：在培养皿中制作步骤S2中的预平衡酸性台氏液滴和步骤S1中的预平衡胚胎培养液滴；
[0011]S4：去透明带处理：污染胚胎在步骤S0的预平衡洗涤液中洗涤，再放入步骤S3的预平衡酸性台氏液滴中，至透明带溶解5
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10秒，再置于步骤S3的预平衡胚胎培养液滴中洗涤，得去透明带胚胎
[0012]S5：胚胎培养：将步骤S4中去透明带胚胎置于time
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lapse培养皿内培养，或正常培养皿内倒置培养，再置于培养箱中培养24
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48h；
[0013]S6：胚胎镜检和挑选：将步骤S5中胚胎在高倍镜下镜检，挑选无污染胚胎继续在培养箱中培养至囊胚，再进行胚胎移植或冻存。
[0014]本专利技术人发现，胚胎在体外受精后，一般要体外培养5天后进行移植，胚胎体外培养的第1～3天中，第二天污染发现率最高，其次是第一天和第三天，推测可能与微生物的来源、生长模式及培养液中的抗生素半衰期有关。微生物在体外培养液中生长繁殖呈现迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期的生长模式，第一天可能是细菌的迟缓期生长，无论内源或外源性的细菌来源，在第一天由于微生物繁殖量的限制，部分菌种形态无法在观察胚胎生长时发觉；第二天可能是细菌从对数期到稳定期的生长，细菌繁殖量逐渐达到峰值，此时极易肉眼观察到培养液滴的浑浊，显微镜下也易观察到大量细菌生长；第三天污染推测可能与少部分菌种生长速度缓慢有关。因此，本专利技术在S5步骤将处理后的胚胎培养24
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48后进行胚胎镜检，在高倍镜下挑选无污染的胚胎进行继续培养至囊胚。
[0015]步骤S5中，胚胎培养在time
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lapse培养皿内，或普通培养皿内倒置培养，time
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lapse培养皿是小孔培养皿，由于胚胎去掉透明带后缺少了束缚作用，所以使用小孔培养皿可以对其进行补偿。也可以选择在普通培养皿内倒置培养，就是将液滴倒过来，这样液滴地下的拱底也可以起到相似的作用。
[0016]进一步的，所述S0步骤中预平衡洗涤液的制备在培养板中进行，且预平衡洗涤液每孔0.5
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2mL；或所述S0步骤中预平衡洗涤液的制备在培养皿中进行，且预平衡洗涤液每滴大于50μL。
[0017]进一步的，所述的受精液为GIVF，所述的胚胎培养液为G1
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plus。其中GIVF和G1
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plus均为可在市场上商品化购置的产品。
[0018]进一步的，所述S0、S1、S5、S6步骤的培养箱条件为37℃、21％O2、5％CO2。
[0019]进一步的，S3步骤中的培养皿为3003培养皿盖，所述预平衡酸性台氏液滴2
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6滴和预平衡胚胎培养液滴4
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10滴，每滴为20μL。
[0020]进一步的，所述步骤S4中污染胚胎在步骤S0预平衡洗涤液中洗涤的方法为逐孔洗涤，洗涤孔数大于5孔；或逐滴洗涤，洗涤滴数大于5滴。洗涤后将污染胚胎放入酸性台氏液滴中，用剥卵针来回轻轻拨动胚胎至透明带溶解。置于酸性台氏液前，尽量少带培养液，因为培养液中的缓冲液会中和酸性台氏液。消化过程中在显微镜下进行观察，以减少暴露在酸性台氏液中时间。保持酸性台氏液的温度(理想温度为37℃)，因为低温会使消化效率降
低。
[0021]进一步的，所述步骤S4中将污染胚胎置于步骤S3的预平衡胚胎培养液滴中洗涤时，使用剥卵针快速拨动，并更换新的剥卵针将胚胎移入新的预平衡胚胎培养液滴，洗涤5
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6次。
[0022]进一步的，所述步骤S4中的污染胚胎在步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种污染胚胎的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：S0：预平衡洗涤液的制备：将受精液或胚胎培养液在培养箱中平衡过夜，得预平衡洗涤液；S1：预平衡胚胎培养液的制备：将胚胎培养液在培养箱中平衡过夜，得预平衡胚胎培养液；S2：预平衡酸性台氏液的制备：将酸性台氏液在37℃平衡15
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60min，得预平衡酸性台氏液；S3：液滴制备：在培养皿中制作步骤S2中的预平衡酸性台氏液滴和步骤S1中的预平衡胚胎培养液滴；S4：去透明带处理：污染胚胎在步骤S0的预平衡洗涤液中洗涤，再放入步骤S3的预平衡酸性台氏液滴中，至透明带溶解5
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10秒，再置于步骤S3的预平衡胚胎培养液滴中洗涤，得去透明带胚胎；S5：胚胎培养：将步骤S4中去透明带胚胎置于time
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lapse培养皿内培养，或普通培养皿内倒置培养，再置于培养箱中培养24
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48h；S6：胚胎镜检和挑选：将步骤S5中胚胎在高倍镜下镜检，挑选无污染胚胎继续在培养箱中培养至囊胚，再进行胚胎移植或冻存。2.如权利要求1所述的污染胚胎的处理方法，其特征在于，所述S0步骤中预平衡洗涤液的制备在培养板中进行，且预平衡洗涤液每孔0.5
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2mL；或所述S0步骤中预平衡洗涤液的制备在培养皿中进行，且预平衡洗涤液每滴大于50μL。3.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑞岐，王文军，区颂邦，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：