肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法技术

本申请公开了肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法，与现有技术相比，本申请通过检测两个肺癌ctDNA甲基化位点，可以有效判断早期肺癌的发生情况，技术简单，可在基层医院开展，相较NGS，大幅减低了检测成本，提高了检测效率。提高了检测效率。提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法


[0001]本申请涉及肺腺癌诊断检测领域，更具体地说，尤其涉及一种肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法。

技术介绍

[0002]根据美国癌症学会官方期刊《临床医师癌症杂志》发布的“2018年全球癌症统计数据”报告，肺癌依旧是全球发病率(11.6％)和死亡率(18.4％)第一位的恶性肿瘤。目前，每年通过胸片或者CT检查发现肺部有结节的人群逐渐增多。
[0003]肺结节是肺内占位性病变。根据其直径大小来定义，肺内直径≤3cm的类圆形或不规则形病灶，可单发或者多发，称之为肺结节。肺结节直径在0.5cm
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1cm属于肺小结节，直径＞3cm则称为肿块。根据CT影像学表现，肺结节可以分为纯磨玻璃结节、混合磨玻璃结节和实性结节。纯磨玻璃结节就像磨砂玻璃一样，呈现出云絮状的阴影；实性结节则是肺内密度比较高的阴影；混合磨玻璃结节，既包含实性成分，也包含磨玻璃成分，通常实性成分在磨玻璃成分中间。胸膜凹陷征、引流线征、血管集束征、毛刺征、棘突征、分叶征、空泡和细支气管充气征等CT影像改变，都是肺结节恶变的征象。其中，恶变概率的排列顺序应该是：混合磨玻璃结节＞磨玻璃结节＞实性结节。
[0004]国际肺癌研究协会(IASLC)提倡使用液体活检来诊断非小细胞肺癌(NSCLC)。血浆游离肿瘤DNA(ctDNA)甲基化液体活检最大的优势就是可以在超早期通过常规手段无法检测到的情况下检测出是否有细胞癌变的可能。DNA甲基化具有细胞组织特异性的特点，具有极高的特异性，适合用于疾病的早期诊断。
[0005]目前，肺癌ctDNA甲基化的检测手段多为NGS，该方法耗时长，费用较高，需要专业人员进行生信分析，因此，不利于在基层医院临床推广。
[0006]因此，怎样提高肺癌ctDNA甲基化的检测效率，已成为本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本申请提供了一种肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法，能提高肺癌ctDNA甲基化的检测效率。
[0008]本申请提供的技术方案如下：
[0009]本申请提供一种基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的引物，包括：内参引物与检测引物，所述检测引物用于检测肺腺癌特异性DNA甲基化标志物，所述肺癌特异性DNA甲基化标志物包括：ALX3基因、HOXC13基因。
[0010]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述检测引物用于扩增所述肺癌特异性DNA甲基化标志物的一段序列。
[0011]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述ALX3基因的引物序列如下：
[0012]引物1a：GGCGTAGTTGCGCGTTTATTC；AAACCCGCCTTATTTCCCG
[0013]探针1a：TGGATTGGAAACGTTTCGAGTCGGTTATTT
[0014]引物1b：CGAAGAGGGAATTCGTTTTATTTTTC；CAACTACGCGCTCACTCG
[0015]探针1b：TTAAAATAATCGGTTCGGAGCGTTTTTAGT。
[0016]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述HOXC13基因的引物序列如下：
[0017]引物2a：GATTTGGGGGATTCGAGTTGC；GAACGAACGATAACTAAAAAACGCG
[0018]探针2a：CAACTAAACCCGCTCGTTTCCCGCCA
[0019]引物2b：GTGGTTAGGGGACGC；AAAATCTAAAAAACCCGAACTACG
[0020]探针2b：TAGTTGAGTTCGTTCGTTTTTCGTTATTGT。
[0021]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，还提供一种基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的试剂盒，包括：所述的基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的引物，洗涤液，纯化液，DNA提取液，阳性对照与阴性对照。
[0022]优选地，所述洗涤剂为纯化水。
[0023]优选地，所述纯化液为异丙醇或乙醇。
[0024]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述试剂盒为荧光PCR试剂盒，所述试剂盒用于检测肺癌特异性DNA甲基化位点。
[0025]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述转化液为亚硫酸盐溶液。
[0026]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述试剂盒通过检测血浆及其他体液中的肺癌特异DNA甲基化区域，结合内参表达情况，用于早期诊断、筛查和治疗后微小病灶的检测。
[0027]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，还提供一种检测肺腺癌特异DNA甲基化区域的方法，包括以下步骤：
[0028]S1，提取血液样品，分离血浆；
[0029]S2，提取ctDNA样品；
[0030]S3，对ctDNA样品进行亚硫酸盐转化处理；
[0031]S4，进行甲基化特异性PCR：使用所述的肺腺癌诊断检测的试剂盒实时荧光甲基化特异性PCR扩增转化后的ctDNA，以检测ALX3基因或HOXC13基因甲基化区域；
[0032]S5，对检测的甲基化区域结果进行比对。
[0033]进一步地，在本专利技术一种优选的方式中，所述方法用于区分肿瘤和正常组织。
[0034]本专利技术所提供的技术方案，与现有技术相比，通过检测两个肺癌ctDNA甲基化位点，可以有效判断早期肺癌的发生情况，技术简单，可在基层医院开展，相较NGS，大幅减低了检测成本，提高了检测效率。
附图说明
[0035]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036]图1为本专利技术实施例提供的基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的试剂盒检测的ALX3基因或HOXC13基因的甲基化区域比较图；
[0037]图2为本专利技术实施例提供的检测肺腺癌特异DNA甲基化区域方法的步骤流程图。
具体实施方式
[0038]为了使本领域的技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合申请实施例中的附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0039]需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件上，它可以直接在另一个元件上或者间接设置在另一个元件上；当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。
[0040]需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、下”、“本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的引物，其特征在于，包括：内参引物与检测引物，所述检测引物用于检测肺腺癌特异性DNA甲基化标志物，所述肺癌特异性DNA甲基化标志物包括：ALX3基因、HOXC13基因。2.根据权利要求1所述的基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的引物，其特征在于，所述检测引物用于扩增所述肺癌特异性DNA甲基化标志物的一段序列。3.根据权利要求2所述的基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的引物，其特征在于，所述ALX3基因的引物序列如下：引物1a：GGCGTAGTTGCGCGTTTATTC；AAACCCGCCTTATTTCCCG探针1a：TGGATTGGAAACGTTTCGAGTCGGTTATTT引物1b：CGAAGAGGGAATTCGTTTTATTTTTC；CAACTACGCGCTCACTCG探针1b：TTAAAATAATCGGTTCGGAGCGTTTTTAGT。4.根据权利要求3所述的基于血浆ctDNA的肺腺癌诊断检测的引物，其特征在于，所述HOXC13基因的引物序列如下：引物2a：GATTTGGGGGATTCGAGTTGC；GAACGAACGATAACTAAAAAACGCG探针2a：CAACTAAACCCGCTCGTTTCCCGCCA引物2b：GTGGTTAGGGGACGC；AAAATCTAAAAAACCCGAACTACG探针2b：TAGTTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马辰凯，李进，杜鑫，
申请(专利权)人：湖南聚点生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：