一种用于捕获mRNA的层析介质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于捕获mRNA的层析介质及其制备方法，结构为SP

【技术实现步骤摘要】
一种用于捕获mRNA的层析介质及其制备方法


[0001]本专利技术涉及层析介质及其制备方法，特别涉及一种用于捕获mRNA的层析介质及其制备方法。

技术介绍

[0002]早在上世纪90年代，科学家就将体外合成的mRNA注射入小鼠体内，发现其能够在小鼠体内被翻译成相关的活性蛋白，并产生了免疫应答，可以发挥疫苗的作用，这便是mRNA疫苗的雏形。但由于技术所限，mRNA在稳定性、安全性以及药物呈递方面存在诸多瓶颈。经过30年的发展，mRNA的合成、修饰、递送技术有了长足的进步，特别是新冠病毒的大流行，促使人类历史上第一款mRNA疫苗被批准用于疾病预防，在有效性方面mRNA疫苗明显高于传统技术疫苗，这直接促进了mRNA预防和治疗产品的快速发展。
[0003]传统的mRNA生产制备方法需要很多纯化步骤，使用大量的有害试剂，因此对于大规模生产的下游纯化阶段是一个非常不利的因素。目前业内常用的mRNA纯化方法包括反相、亲和、离子交换及分子筛等，反向色谱是使用较为广泛的方法，但该方法的载量较低，并需要使用易燃、有毒有害的溶剂。而离子交换层析和分子筛纯化应用却受限于较差的选择性和较低的载量。
[0004]根据目前相关技术的发展，大多数mRNA产品在修饰过程中都会有一个PolyA尾巴，长度可达250nt，这为后续纯化带来了很大的便利。将一定长度的碱基T作为配基键合至固相载体上，可通过T和A之间的碱基配对作用捕获mRNA，这不仅可以去除绝大多数的工艺相关杂质，如DNA模板、RNA聚合酶等，还可以去除产品相关杂质，如没有PolyA尾巴的mRNA。当配基为单链多聚胸腺嘧啶时，其与mRNA的Poly(A) 尾巴结合过强，不容易洗脱，因此可以采用结合能力较弱的单链多聚脱氧胸腺嘧啶作为配基，相关产品包括键合有Oligo dT的磁珠、纤维素、聚乙烯
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二乙烯基苯微球等。在这些产品中，磁珠由于原理所限，只能用于实验室研究，提纯少量mRNA；纤维素由于基质太软，不利于mRNA产品下游大规模纯化；而聚乙烯
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二乙烯基苯微球刚性好，可用于mRNA产品的工业纯化，但由于其表面疏水性较强，其它杂质可通过疏水作用结合到微球上，在后续的洗脱步骤混入mRNA产品中，杂质去除效果不理想。随着生物制药技术的发展，层析技术已经被广泛用于生物大分子药物下游的大规模纯化，因此，有必要开发一种刚性好、表面亲水性好、载量高、易使用的Oligo dT亲和层析介质，专门用于mRNA预防和治疗生物制品的下游纯化。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术目的是提供偶联效率高的用于捕获mRNA的层析介质。
[0006]本专利技术另一目的是提供所述偶联效率高的用于捕获mRNA的层析介质的制备方法。
[0007]技术方案：本专利技术提供一种用于捕获mRNA的层析介质，结构如下：
[0008]SP
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R
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Oligo dT
[0009]其中，SP为基础介质，Oligo dT为亲和配基，R为基础介质偶联Oligo dT的间隔臂。
在这一结构中，基础介质作为Oligo dT配基的固体支撑物，具有合适的孔结构，可以提供足够大的比表面积，用于提高mRNA的结合载量，此外，基础介质表面还具有极好的亲水层，尽可能降低杂质的非特异性结合。Oligo dT为单链多聚脱氧胸腺嘧啶，用于结合具有PolyA尾巴的mRNA。间隔臂R的作用为将Oligo dT配基偶联至固体支撑物上，在结合
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洗脱模式的纯化步骤中尽可能避免配基混入产品中，同时，间隔臂R选用亲水性好的试剂，降低杂质的非特异性结合。
[0010]进一步地，所述基础介质为琼脂糖微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球或硅胶微球中的一种。琼脂糖微球具有高交联度，有一定的机械性能，可用于工业层析纯化，其表面未经任何修饰且具有大量天然的羟基，亲水性极佳，对杂质的非特异性结合可忽略不计。聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球和硅胶微球均为单分散多孔微球，相比于琼脂糖微球，其孔道为刚性，传质快，有利于mRNA的结合，单分散微球可提高层析柱填装的可重复性，同时微球表面经过亲水性修饰，具有大量羟基，可以尽可能降低杂质的非特异性结合。
[0011]进一步地，所述琼脂糖微球表面未经任何修饰且具有天然的羟基。
[0012]进一步地，所述聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球和硅胶微球表面经过亲水性修饰，具有羟基。
[0013]进一步地，所述Oligo dT为具有10到30个碱基的多聚脱氧胸腺嘧啶，且在5
’
端修饰有氨基。
[0014]进一步地，所述间隔臂R的两端都具有环氧基、一端与介质偶联，另一端与Oligo dT 末端的氨基偶联，中间具有任意化学结构。
[0015]进一步地，所述间隔臂制备用的试剂采用亲水性好的1，2
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乙二醇二缩水甘油醚、1， 4
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丁二醇二缩水甘油醚、1，6
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己二醇二缩水甘油醚、1，3
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丙二醇二缩水甘油醚或丙三醇三缩水甘油醚中的一种或任意多种组合。
[0016]进一步地，所述基础介质粒径为5μm
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150μm；粒径均一度可以为单分散、多分散；基础介质为无孔的，或者包括一个或多个孔隙，孔径为
[0017]所述的用于捕获mRNA的层析介质的制备方法，包括如下步骤：
[0018](1)将基础介质活化，得到表面修饰有大量环氧基或醛基的活化介质；
[0019](2)将Oligo dT偶联至活化介质上；
[0020](3)将多余醛基或环氧基封闭处理，得到Oligo dT亲和介质。
[0021]优选方案如下：
[0022]当基础介质为琼脂糖微球时，使其表面具有大量环氧基的活化方法为：将琼脂糖微球与0.2
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2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合均匀，在搅拌条件下加入和介质等体积的间隔臂试剂，将温度升高至30
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45℃，连续搅拌反应2
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5h，依次用乙醇和水清洗掉多余试剂，即可得到表面修饰有大量环氧基的活化介质；而使其表面具有大量醛基的活化方法为：将琼脂糖微球与0.1
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0.5mol/L高碘酸钠溶液等体积混合均匀后在室温下搅拌反应0.5
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3 h，然后用水清洗掉多余试剂及副产物后即可得到表面修饰有大量醛基的活化介质，且与高碘酸钠溶液反应后形成的具有末端醛基的糖链可作为间隔臂；
[0023]当基础介质为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球或硅胶微球时，使其表面具有大量环氧基的活化方法为：将基础介质与0.2
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2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合均
匀，在搅拌条件下加入和介质等体积的间隔臂试剂，将温度升高至30
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于捕获mRNA的层析介质，其特征在于：结构如下：SP
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R
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Oligo dT其中，SP为基础介质，Oligo dT为亲和配基，R为基础介质偶联Oligo dT的间隔臂。2.根据权利要求1所述的用于捕获mRNA的层析介质，其特征在于：所述基础介质为琼脂糖微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球或硅胶微球中的一种。3.根据权利要求2所述的用于捕获mRNA的层析介质，其特征在于：所述琼脂糖微球表面未经任何修饰且具有天然的羟基。4.根据权利要求2所述的用于捕获mRNA的层析介质，其特征在于：所述聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球和硅胶微球表面经过亲水性修饰，具有羟基。5.根据权利要求1所述的用于捕获mRNA的层析介质，其特征在于：所述Oligo dT为具有10到30个碱基的多聚脱氧胸腺嘧啶，且在5
’
端修饰有氨基。6.根据权利要求1所述的用于捕获mRNA的层析介质，其特征在于：所述间隔臂R的两端都具有环...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕小林，丁良龙，陈迪安，胡新妹，毛慧明，
申请(专利权)人：苏州赛分科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：