基于Au-Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于Au

【技术实现步骤摘要】
基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于沙门氏菌检测
，具体涉及一种基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]当今世界，食品安全问题频发，越来越多的消费者和相关部门开始关注食品安全问题。据估计，全世界每年有六亿人口因食用不安全的食品而患病，并导致近四十二万人死亡，低收入和中等收入国家每年因受污染的食品造成的生产力和医疗费用损失达千亿美元。根据食源性疾病暴发数据库的统计，存在于食品中的病原体的种类很多，包括大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等，这些病原体均不同程度的以食品为媒介对人体健康造成一定的威胁。其中，沙门氏菌属细菌是一种革兰氏阴性菌，在自然界具有广泛的宿主，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接的途径传播，一直被认为是世界范围内食源性疾病最重要的病因之一。我国现行食品安全国家标准对沙门氏菌的限量控制是针对即食类预包装食品：GB 29921
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2013中对肉制品、水产制品、即食蛋制品等11种即食预包装食品中沙门氏菌的限量要求均为：n＝5，c＝0，m＝0CFU(n：同一批次产品采取的样品件数；c：最大允许超出m值的样品数；m：微生物指标可接受水平的限量值)。
[0003]对于沙门氏菌的检测，常规的平板菌落计数鉴定方法虽比较灵敏，但是所需时间长，操作繁琐，需要较为严格的检测环境。近几年提出的其他检测方法，例如：聚合酶链反应(PCR)分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)，虽在一定程度上提高了检测效率以及特异性识别能力，但是仍然存在着检测前需富集，检测需要大型仪器等问题。因此，上述方法难以实现沙门氏菌的实时、快速检测。
[0004]由于食源性病原体通常以很低的剂量存在于复杂的生物基质中，检测前进行捕获富集有助于提高检测的灵敏度。磁性材料实现磁分离就是将连接有特异性识别靶标生物亲和分子(抗体、适配体)的磁性纳米材料与含有靶标的复杂样品混合，使得磁性材料与目标物结合并利用磁场作用进而达到分离和富集的目的。氧化铁基磁性纳米粒子(MNPs)由于其能被磁场操控、比表面积大、在溶液中的动力学快等特性而被广泛地应用到细菌检测平台中(Congying Wen,et al.ACS Appl.Mater.Interfaces,9(2017),9416
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9425；S.Zhan，et al.J.Hanzard.Mater,274(2014),115
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123)。这些方法虽然可以实现快速磁响应和磁分离，但磁性纳米材料往往需要与其他方法联用，才能最终实现病原体的检测。
[0005]比色法因具有颜色易于裸眼观察、成本低、操作简单等优点，更适用于沙门氏菌的实时、快速检测。现有的沙门氏菌比色法主要是利用经抗体修饰的贵金属纳米材料(金纳米粒子、银纳米粒子等)进行检测，在沙门氏菌与贵金属纳米材料结合之后，形成纳米粒子聚集体，进而导致其在紫外光谱中吸收强度或者吸收峰位置发生改变，裸眼可观测到颜色变化(S,Wang,et al.Chemistry
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A European Journal,16(2010):5600
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5606；Qingmei Chen,et al.Talanta,221(2021)121476；Changqing Zhu，et al.Analytical Methods,8(2016):
6560
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6565)。这些方法虽然在一定程度上实现了比色检测，但灵敏度并未能达到实际检测要求，且裸眼分辨率较低，仅为一种颜色的深浅变化。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用，可通过磁捕获及比色法快速检测食品中的沙门氏菌。
[0007]本专利技术为了实现上述目的，采用的技术解决方案是：
[0008]一种基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，包括如下步骤：
[0009](1)制备Fe3O4纳米粒子：向三颈烧瓶中加入1
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十八烯和油酸，在100～130℃下搅拌混合均匀并保温15～30min，然后注入Fe(CO)5，升温至280～300℃并反应1.5～2h，且在整个过程中使用氮气鼓泡，反应完成后冷却至室温；然后加入丙酮离心，并向沉淀产物中添加TMAH溶液，离心分离得到Fe3O4纳米粒子，将Fe3O4分散在去离子水中，得到Fe3O4分散液，记为MNPs；
[0010](2)制备Au
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Fe3O4异二聚体纳米粒子：在三颈烧瓶中加入MNPs、去离子水及柠檬酸钠溶液，并在80～120℃下搅拌混合均匀，然后加入HAuCl4溶液，继续在80～120℃下搅拌混合并反应20～30min；反应完成后间隔5min，再次加入等体积的HAuCl4溶液及等体积的柠檬酸钠溶液，在80～120℃下搅拌混合并反应3～6min，反应完毕后得到Au
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Fe3O4异二聚体纳米粒子，记为DBNPs；然后冷却至室温，放入冰箱内4℃保存待用；
[0011](3)制备Au
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Fe3O4异二聚体识别探针：将步骤(2)制备得到的DBNPs与HS
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PEG
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COOH混合，并在37℃下摇晃50～60min，然后加入pH为6.8、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，在室温下轻轻摇动以激活DBNPs表面的羧基，并孵育20～40min；然后用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，并将其分散在pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液中；然后加入沙门氏菌单克隆抗体并振荡反应3～4h，反应完成后，用pH为7.2、浓度为0.01mmol/L的PBS溶液洗涤去除多余的沙门氏菌单克隆抗体，得到特异性识别沙门氏菌的免疫探针，即Au
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Fe3O4异二聚体识别探针，记为IDBNPs，并加入pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，放置于冰箱内在4℃储存。
[0012]进一步地，所述步骤(1)中1
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十八烯、油酸、Fe(CO)5、丙酮、TMAH溶液、去离子水的体积比为10～20:1～2:0.2～0.4:10～20:10～25:10～20，所述TMAH溶液的浓度为10％，所述氮气的流速为10～20mL/min。
[0013]进一步地，所述步骤(2)中MNPs、去离子水、柠檬酸钠溶液、HAuCl4溶液的体积比为0.1～0.2:10～20:0.2:～0.5:0.15～0.25，所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为8～10mg/mL，所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
[0014]进一步地，所述步骤(2)中得到的Au
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Fe3O4异二聚体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备Fe3O4纳米粒子：向三颈烧瓶中加入1
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十八烯和油酸，在100～130℃下搅拌混合均匀并保温15～30min，然后注入Fe(CO)5，升温至280～300℃并反应1.5～2h，且在整个过程中使用氮气鼓泡，反应完成后冷却至室温；然后加入丙酮离心，并向沉淀产物中添加TMAH溶液，离心分离得到Fe3O4纳米粒子，将Fe3O4分散在去离子水中，得到Fe3O4分散液，记为MNPs；(2)制备Au
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Fe3O4异二聚体纳米粒子：在三颈烧瓶中加入MNPs、去离子水及柠檬酸钠溶液，并在80～120℃下搅拌混合均匀，然后加入HAuCl4溶液，继续在80～120℃下搅拌混合并反应20～30min；反应完成后间隔5min，再次加入等体积的HAuCl4溶液及等体积的柠檬酸钠溶液，在80～120℃下搅拌混合并反应3～6min，反应完毕后得到Au
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Fe3O4异二聚体纳米粒子，记为DBNPs；然后冷却至室温，放入冰箱内4℃保存待用；(3)制备Au
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Fe3O4异二聚体识别探针：将步骤(2)制备得到的DBNPs与HS
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PEG
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COOH混合，并在37℃下摇晃50～60min，然后加入pH为6.8、浓度为0.01mol/L的PBS溶液，在室温下轻轻摇动以激活DBNPs表面的羧基，并孵育20～40min；然后用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，并将其分散在pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液中；然后加入沙门氏菌单克隆抗体并振荡反应3～4h，反应完成后，用pH为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗涤去除多余的沙门氏菌单克隆抗体，得到特异性识别沙门氏菌免疫探针，即Au
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Fe3O4异二聚体探针，记为IDBNPs，放置于冰箱内在4℃储存。2.根据权利要求1所述的一种基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中1
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十八烯、油酸、Fe(CO)5、丙酮、TMAH溶液、去离子水的体积比为10～20:1～2:0.2～0.4:10～20:10～25:10～20，所述TMAH溶液的浓度为10％，所述氮气的流速为10～20mL/min。3.根据权利要求1所述的一种基于Au
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Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中MNPs、去离子水、柠檬酸钠溶液、HAuCl4溶液的体积比为0.1～0.2：10～20:0.2:～0.5:0.15～0.25，所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为8～...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾景斌，赵田雨，张雨，温聪颖，刘宏玉，崔淑华，唐仕明，崔炳文，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：