3羟基根皮苷的制备及其工艺优化制造技术

本发明专利技术涉及3羟基根皮苷的制备及其工艺优化方法，其反应条件温和，生产能耗小，环境污染少，可操作性强，步骤包括：取一定体积的粗酶液，加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min。确定的实际取值为根皮苷浓度1.20mM，转化时间6.0h，粗酶浓度13.0 U*mL-1

【技术实现步骤摘要】
3羟基根皮苷的制备及其工艺优化


[0001]本专利技术涉及一种微生物转化根皮苷生产3羟基根皮苷的方法。

技术介绍

[0002]湖北海棠原产地适应性极强，在我国广为分布，但湖北西部连片分布，是湖北海棠原产地。是良好的可利用资源。具有药用、食用、观赏多种价值。卫生部2014年第20号公告批准湖北海棠（茶海棠）叶为新食品原料。《湖北省中药材质量标准》2009年版收载了药材质量标准。
[0003]湖北海棠叶作茶饮用已有千年历史。含有根皮苷、3-羟基根皮苷、齐墩果酸、熊果酸等化合物。具有保肝、雌激素样作用等多种作用。其作用是多种成分共同作用的结果。湖北海棠叶早期以根皮苷为主要成分。为了控制海棠茶内在成分比例，优化药理作用。同时制备不同成分，进一步扩大湖北海棠的应用。我们专利技术了一种微生物转化根皮苷生产3羟基根皮苷的方法。
[0004]
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于：控制海棠茶内在成分比例，优化药理作用，同时制备不同成分，进一步扩大湖北海棠的应用。具体地提供了一种制备及其工艺优化方法：它包括如下操作步骤：（1）粗酶的制备：
①
菌种的扩大培养：取斜面菌种接种至平板培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7d，备用。
[0006]②
菌种液体发酵：a.接种用菌悬液制备：将平板上菌种接种于装有玻璃珠的200 mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，制得种子液;b.液体发酵：以5%的接种量吸取种子液至200 mL 发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下培养。
[0007]③
粗酶获得与酶活测定：a.粗酶：收集发酵液，过滤，弃去菌丝体，上清液用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，收集沉淀;沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶;b.多酚氧化酶活性测定：粗酶用适宜缓冲液溶解，取1mL粗酶液+2mL0.1mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液+3mL反应液（pH6.5缓冲液：0.1%脯氨酸：0.1M邻苯二酚=10:2:3），37℃，反应10min，以每分钟OD
420
值增加0.001为一个酶活力单位，以沸水浴灭活1mL粗酶液+2mL 0.1mol/L的pH6.5磷酸缓冲液+3mL反应液同步反应做空白。
[0008]（2）根皮苷的生物转化方法：取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应。
[0009]（3）取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液
中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量；实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物。
[0010]（4）分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分，浓缩干燥得到黄色无定形粉末3-羟基根皮苷。
[0011]（5）3-羟基根皮苷鉴定：化合物黄色无定形粉末，其ESI-MS质谱显示其准分子离子峰475[M+Na]+
，结合NMR数据，得出其分子式为C
21
H
24
O
11
，推测化合物可能为查耳酮类型的黄酮类化合物。
附图说明
[0012]图1 根皮苷浓度和转化时间交互影响效价的曲面图和等高线图图2 根皮苷浓度和粗酶浓度交互影响效价的曲面图和等高线图图3 粗酶浓度和转化时间交互影响效价的曲面图和等高线图图4 3-羟基根皮苷的结构图5 1
H-NMR图谱图6 13
C-NMR、DEPT图谱
具体实施方式
[0013]本具体实施方式采用以下技术方案：1材料与仪器1.1实验材料对照品：根皮苷（≥98%）、3-羟基根皮苷（≥98%），实验室自制；甲醇、乙腈，色谱纯，其余试剂为分析纯。毛栓菌（Trametes trogii）：购于中科院微生物所,菌种编号:5.629。
[0014]PDA培养基（1L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
[0015]液体发酵培养基；马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3g，MgSO4 3g，VB10.01g，CaCl2 0.05g，麸皮10g，酵母浸粉6g，酪氨酸 0.182g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
[0016]1.2实验仪器高效液相色谱仪，DIONEX Ultimate 3000；检测器，Ultimate 3000 Diode Array Detector；色谱柱：COSMOSIL C18 (250
×
4.6mm, 5μm）；HEV-50型自动灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；SB-100旋转蒸发仪：日本EYELA公司；0.22 μm尼龙膜针筒过滤器：天津津腾实验设备有限公司; HH-6数显恒温水浴锅：金坛市城西春兰实验仪器厂；ME215S型十万分之一电子天平：德国Sartorios公司。
[0017]1.3实验方法1.3.1 主要成分测定的色谱条件色谱条件：Cosmail C18色谱柱（4.6 mm
×
250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（25:75，V/V）；检测波长为284 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。
[0018]1.3.2 根皮苷、3-羟基根皮苷标准曲线的制作精密称取0.1000 g的根皮苷和0.0680g的3-羟基根皮苷标准品，置于100 mL容量瓶中，
甲醇定容至刻度线，摇匀，即得质量浓度为1.0 mg*mL-1的根皮苷和0. 68 mg*mL-1的3-羟基根皮苷标准品溶液。精密吸取标准溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL，分别置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配成质量浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL的系列根皮苷标准溶液，34 μg/mL、68 μg/mL、136 μg/mL、340 μg/mL、680 μg/mL的系列3-羟基根皮苷标准溶液。吸取10 μL，于上述色谱条件下进样分析，每个质量浓度进样3次，计算平均峰面积。以根皮苷和3-羟基根皮苷质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得根皮苷标准回归方程为：Y=0.2915X-0.2599（R2=0.9992）、3-羟基根皮苷标准回归方程为：Y=0.112X+1.264（R2=0.9997）。
[0019]1.3.3 粗酶的制备菌种的扩大培养：取斜面菌种接种至平板培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7d，备用。
[0020]菌种液体发酵：（1）接种用菌悬液制备：将平板上菌种接种于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明涉及3羟基根皮苷的制备及其工艺优化方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：（1）粗酶的制备：取斜面菌种于25℃恒温培养箱中培养7d，接种于装有玻璃珠的200 mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶；（2）根皮苷的生物转化方法：取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应；（3）取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量；实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物；（4）分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分；浓缩干燥得到黄色无定形粉末3-羟基根皮苷；（5）3-羟基根皮苷鉴定：化合物黄色无定形粉末，其ESI-MS质谱显示其准分子离子峰475[M+Na]
+
，结合NMR数据，得出其分子式为C
21
H
24
O
11
，推测化合物可能为查耳酮类型的黄酮类化合物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：3-羟基根皮苷生成率按如下公式计算：3-羟基根皮苷生成率=
×
100%，式中：C1为转化液中3-羟基根皮苷的摩尔浓度，g/L；C为反应液原始根皮苷摩尔浓度。3.根据权利要求1、2所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪鋆植，余泇兴，周子键，
申请(专利权)人：恩施硒海棠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：