通过剪接调节恢复CFTR功能制造技术

本发明专利技术提供了能够结合CFTR基因的前体mRNA并且调节其剪接的寡核苷酸，包括包含该寡核苷酸的组合物，及其用途，诸如用于抑制由于突变3849+10Kb C

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过剪接调节恢复CFTR功能
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年5月5日提交的标题为“RESTORATION OF THE CFTR FUNCTION BY SPLICING MODULATION”的美国临时专利申请第62/843,469号的优先权权益，该美国临时专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。
专利

[0003]本专利技术涉及能够结合囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic Fibrosis Trans
‑
membrane conductance Regulator，CFTR)前体mRNA的寡核苷酸及其使用方法，诸如用于抑制由于突变3849+10Kb C
‑
至
‑
T导致的外显子22和23之间的隐秘外显子(cryptic exon)的包含，以及用于治疗囊性纤维化(CF)。
[0004]背景
[0005]囊性纤维化(CF)是一种由CFTR基因突变引起的常见的严重常染色体隐性疾病。CFTR基因编码负责上皮细胞中氯化物转运的氯化物通道。CF的主要表现在肺部，超过90％的死亡与呼吸系统疾病有关。呼吸道疾病与气道上皮的CFTR功能不足有关。
[0006]到今天为止，全世界已经鉴定了约2000种不同的破坏CFTR功能的突变，基于它们对CFTR功能的影响被分为五个不同的类别。I类包括导致非功能性CFTR的突变(大的缺失和终止密码子突变)。II类突变(包括常见的ΔF508)导致异常折叠的CFTR蛋白，该异常折叠的CFTR蛋白被细胞质量控制机制识别并且随后降解，导致顶端细胞膜处不存在成熟的CFTR蛋白。III类突变导致全长CFTR蛋白被整合到细胞膜中，但具有有缺陷的调节，使得不存在CFTR功能。这三类通常导致伴有胰腺功能不全的经典CF表型，尽管肺疾病的严重性有大的差异。导致有缺陷的氯化物传导的CFTR突变被分到IV类。V类突变涉及转录调节异常，导致本来正常CFTR的量减少。后两类通常与较温和的表型和胰腺功能完整有关。具体地，由IV类突变产生的CFTR插入质膜，但由于氯化物渗透和开放通道概率降低，呈现出降低的单通道氯根离子传导。发现在<1％的CF患者中，V类突变产生正常的质膜CFTR。然而，由于转录调节异常，量通常减少。V类突变经常受到剪接机制的影响，并且产生异常剪接的mRNA和正确剪接的mRNA二者，它们的水平在不同的患者之间并且甚至在同一患者的不同的器官之间有所不同。最终，剪接变体导致质膜中功能性CFTR的数量减少。
[0007]约10％
‑
15％的CFTR突变影响基因转录物的正确剪接。其中包括剪接突变3849+10kb C
‑
至
‑
T，其导致在成熟信使RNA(mRNA)中包含84个碱基对的隐秘外显子(被称为“内含子22隐秘外显子包含”突变)。这种突变是世界上第12常见的CFTR突变，其发生在全世界数百名CF患者中(Kerem等人，1997)。通过“反义”寡核苷酸(AO)来校正CFTR基因的异常剪接在Friedman等人，1999中进行了尝试，并且最近在本专利技术人的国际PCT申请公布WO 2014/045283中进行了描述。
[0008]反义寡核苷酸(AO或ASO)施用是用于治疗由剪接突变引起的遗传紊乱的最有前景的治疗方法中的一种。AO是短的合成分子，其可以退火到预测参与前体mRNA剪接的基序。该方法基于剪接转换(splice
‑
switching)。与选定位点结合的AO被预期掩蔽靶向区域并且促
进正常剪接。AO对其靶具有高度特异性，并且不影响细胞中的任何其他序列。常用若干种类型的化学修饰的AO分子，包括：2
’‑
O
‑
甲基
‑
硫代磷酸酯(2
’
OMP)、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(PMO)、肽核酸(PNA)、2
‑
甲氧基乙基硫代磷酸酯(MOE)、约束乙基(cET)、配体缀合反义(LICA)和交替锁核酸(LNA)。
[0009]AO修饰保持了它们的稳定，改善了它们的靶亲和力，并且提供了良好的药代动力学性质和生物稳定性。已经有结论表明，在杜氏肌营养不良(DMD)的鼠模型中，剪接转换AO可以重定向肌营养不良蛋白前体mRNA加工，使得携带过早蛋白质终止信号(无义突变)的外显子可以从成熟的基因转录物中排除，导致较短但仍具有功能性的肌营养不良蛋白亚型。肌营养不良蛋白外显子跳读的进展始终是快速的，有概念验证研究报告，并且公布了对患者进行2OMP和PMO化学物质全身施用的结果。在2016年，FDA为第一种用于杜氏肌营养不良的药物(eteplirsen)授予了加速批准，该药物是用于外显子51跳读的PMO AO。
[0010]除了诱导的外显子跳读之外，AO还可以被设计成掩蔽剪接沉默元件，这些剪接沉默元件减少外显子识别和随后在成熟的mRNA中的包含。脊髓性肌萎缩(SMA)是一种常见的常染色体隐性状况，由SMN1基因缺失以及SMN2外显子7的C>T变异引起，导致其中SMN2外显子7被跳读的异常剪接，导致非功能性基因产物。AO已经被设计成掩蔽附近的侧翼SMN2剪接沉默子元件，以促进全长转录物的合成。向患有严重SMA的新生小鼠幼崽鞘内施用吗啉代低聚物非常成功，显著延长了它们的存活。
[0011]这导致了基于AO的药物Spinraza(Nusinersen)的开发，该药物最近获得了美国食品和药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的批准。该批准是在患有婴儿期出现的SMA的患者的III期临床试验非常成功地完成之后。经治疗的婴儿在运动里程碑的实现方面经历了统计学上显著的改善。这项研究的结果证明了基于AO的剪接调节用于治疗遗传疾病的巨大潜力，并且强调了局部递送对于以最小毒性进行有效治疗的重要性。
[0012]在囊性纤维化治疗的领域中，对于设计成克服迄今为止鉴定的CFTR基因的许多突变并且恢复CFTR功能的新颖、有效的治疗剂存在持续的需求。
[0013]概述
[0014]本专利技术提供了包含寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸能够结合至CFTR前体mRNA，从而调节剪接并且恢复或增强CFTR基因产物的功能。因此，本专利技术鉴定了CFTR前体mRNA内的序列，这些序列被靶向以便调节CFTR前体mRNA的剪接级联。如本专利技术所证明的，调节CFTR前体mRNA剪接可以避免将内含子序列不正确地识别为外显子。作为剪接调节的结果，功能性CFTR蛋白由本来异常的CFTR等位基因以足够的水平产生。本专利技术在其一些实施方案中还提供了用于调节剪接和恢复或增强CFTR基因产物功能的修饰的寡核苷酸。
[0015]本专利技术部分地基于这样的发现：人工“反义”寡核苷酸分子能够靶向并且结合CFTR基因的前体mRNA分子的预定序列，并且该结合可以调节前体mRNA分子剪接成成熟mRNA，随后该成熟mRNA以足够的水平翻译成功能性CFTR蛋白。CFTR前体mRNA分子中的靶是那些被本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子由17个
‑
21个连续碱基组成，与具有3849+10Kb C
‑
至
‑
T突变的CFTR基因的前体mRNA转录物具有至少80％的互补性，并且特征在于至少部分地抑制成熟CFTR mRNA中内含子22隐秘外显子的包含，将正确剪接的成熟CFTR mRNA的百分比增加至少约10％；以及将异常剪接的成熟CFTR mRNA的水平降低至少约20％。2.根据权利要求1所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子与SEQ ID NO:37内的核苷酸序列具有至少80％的互补性。3.根据权利要求1或2所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子与SEQ ID NO:37内的核苷酸序列具有100％的互补性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子由19个连续核苷酸碱基组成。5.根据权利要求1至4中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子由18个连续核苷酸碱基组成。6.根据权利要求1至5中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子包含化学修饰的主链，所述化学修饰的主链包括：磷酸酯
‑
核糖主链、磷酸酯
‑
脱氧核糖主链、2
’‑
O
‑
甲基
‑
硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代主链、肽核酸主链、2
‑
甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、交替锁核酸主链、受约束的乙基主链、硫代磷酸酯主链、N3
’‑
P5
’
磷酸酰胺、2
’‑
脱氧
‑2’‑
氟
‑
β
‑
d
‑
阿拉伯糖核酸、环己烯核酸主链核酸、三环
‑
DNA(tcDNA)核酸主链及其组合。7.根据权利要求1至6中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子包含含有2
’‑
O
‑
甲基硫代磷酸酯(2
’
OMP)修饰或2
’‑
甲氧基乙基(2
’
MOE)修饰的主链。8.根据权利要求1至7中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子包含SEQ ID No:1
‑
25和SEQ ID No:41
‑
44中的一个中所列的核苷酸序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子包含SEQ ID No:1
‑
5和SEQ ID No:41中的一个中所列的核苷酸序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的合成寡核苷酸分子，所述合成寡核苷酸分子包含序列GAUGGAAGA(SEQ ID NO:38)。11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的合成寡核苷酸分子和药学上可接受的载体。12.根据权利要求11所述的药物组合物，所述药物组合物被配制用于口服、鼻、吸入、腹部、皮下、腹膜内或静脉内施用。13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗有相应需要的受试者的囊性纤维化(CF)。14.一种用于在有相应需要的受试者中治疗CF的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的合成寡核苷酸，其中所述合成寡核苷酸抑制成熟CFTR mRNA中内含子22隐秘外显子的包含，将正确剪接的成熟CFTR mRNA的百分比增加至少约10％；并且将异常剪接的成熟CFTR mRNA的水平降低至少约20％，从而治疗所述受试者的CF。15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或更多种CFTR修饰剂。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述CFTR修饰剂选自由以下组成的组：CFTR剪接调节剂、翻译通读剂、CFTR扩增剂、CFTR增强剂和CFTR校正剂。
17.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述CFTR修饰剂选自由以下组成的组：能够抑制成熟CFTR mRNA中内含子22隐秘外显子的包含的不同的合成寡核苷酸分子、阿他卢仑、ELX
‑
02、艾伐卡托、QBW251、PTI
‑
808、VX...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴特，
申请(专利权)人：斯普莱森斯有限公司，
类型：发明
国别省市：