一种虫草真菌新种及其分离鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种虫草真菌新种及其分离鉴定方法，本发明专利技术运用形态和分子相结合的方法准确分离鉴定出三株野生虫草菌株，其中HGF01、XJ46分别是柱状虫草和蝉花，CH01是新种，并在此基础上进行液体培养菌丝体中虫草酸、黄酮和多糖成分检测。三种虫草菌丝体中均含有虫草酸、黄酮和多糖成分，CH01中的虫草酸、黄酮和多糖成分含量与柱状虫草和蝉花相当，不具有显著性差异，具有与柱状虫草和蝉花相同的保健食用价值。再此基础上CH01菌丝中的部分氨基酸种类的含量显著高于柱状虫草和蝉花，且自由基的清除率在一定浓度下显著高于柱状虫草和蝉花，具有较好的氧化功效。有较好的氧化功效。有较好的氧化功效。

【技术实现步骤摘要】
一种虫草真菌新种及其分离鉴定方法
[0001]本专利技术生物材料样品保藏单位名称为：中国科学院微生物研究所，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2021年08月09日，保藏编号为：CGMCC No.23076，分类命名为：虫草菌Cordyceps sp.。


[0002]本专利技术涉及虫草菌分离鉴定
，特别涉及一种虫草真菌新种及其分离鉴定方法。

技术介绍

[0003]我国有着丰富的虫草资源，中国已报道虫草130多种，但还有很多未被发现或记录，如冬虫夏草(C.sinensis)、蛹虫草(C.militaris)和蝉棒束孢(Isaria tenuipes)等是几种常见的虫草属真菌[黄罗冬,马玉凤,王玥等.细虫草资源研究现状及开发利用进展[J].食用菌学报,2019,26(02):141
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151.梁宗琦.中国真菌志.第三十二卷.虫草属[M].北京：科学出版社.2007:1
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190]。虫草因其寄主种类和子座形态具有一定差异，而具有复杂的形态特征。因此根据虫草的形态特征可以初步对虫草进行分类鉴定，同时在鉴定虫草时，形态鉴定也较其它方式更方便快捷[贺瑞红.拟黑虫草形态学、遗传分化及区系真菌多样性研究[D].山西大学,硕士论文,2019.07.]。但是，正因为虫草形态特征的复杂，所以仅依靠传统形态学方法难以准确进行鉴定及正确分类。
[0004]目前，形态学鉴定结合分子生物学鉴定的方法广泛应用于虫草属真菌的物种鉴定中。6个基因序列片段进行系统发育分析，对物种的鉴定更准确。虫草属真菌的物种鉴定及分类地位对其活性成分、药理作用和产品开发等相关研究具有重要意义(Sung GH,Hywel
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Jones NL,Sung JM,et al.Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi[J].Sudies in Mycol,2007,57(01):5
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59.陈自宏.兰坪虫草生物学研究[D].云南大学,博士论文,2013,12
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21.)。
[0005]虫草属真菌因含有多种活性成分，如虫草素、多糖、超氧化物歧化酶、虫草酸、麦角甾醇、蛋白质、类黄酮、氨基酸等，故具有重要的食药用价值和研究开发潜力。相关研究表明，虫草酸(D
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甘露醇)具有抗肿瘤、利尿、抗氧化、促进新陈代谢等积极作用，可预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞等疾病[万琴,刘向阳,王松涛.蛹虫草液体发酵及其应用的研究进展[J].食品与发酵科技,2017,53(1):88
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91,114.]；黄酮类化合物具有抗氧化、调节免疫系统等能力，并可以通过消除自由基、诱导某些细胞凋亡和调节免疫系统等方式达到抗肿瘤作用[王薇.虫草ITS序列分子进化分析及其复合营营养液的体外细胞作用研究[D].西南交通大学,硕士论文,2012,19
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25.]；虫草多糖对抗氧化、抗衰老和维持肠道形态等具有积极作用。
[0006]由于野生虫草资源有限，人工栽培虫草具有时间长、易退化、难以掌握栽培技术等特点，无法获得大量的生物活性物质，难以满足当前市场需求。通过液体培养的方式，既可以提高生产效率，又可以提高产量，在快速获取大量菌丝体的同时也可以从菌丝体和发酵
液中提取各种生物活性物质[Liu,A.
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J.,and Zhang,Y.
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M.Structural properties of polysaccharides from cultivated fruit bodies and mycelium of Cordyceps militaris,Carbohydrate Polymers,2016,142:63
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72.冉茂芳.蛹虫草液体发酵及其活性提取物对小鼠肠道和生理的影响研究[D].重庆大学,硕士论文,2019,3.]。研究发现，一些虫草真菌的发酵菌丝体与真菌子实体具有相似的药理作用，并已广泛应用于各种食品保健品中。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题：本专利技术利用形态学和分子生物学方法(ITS、TEF
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1序列)对虫草属三种野生虫草真菌进行系统发育分析，准确鉴定物种，在此基础上对三种虫草液体培养菌丝体中的虫草酸、黄酮、多糖和氨基酸含量以及自由基清除率进行比对。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：
[0009]一种虫草真菌新种，所述虫草真菌新种为虫草菌(Cordyceps sp.)CH01，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2021年08月09日，保藏编号为：CGMCC No.23076。
[0010]一种虫草真菌新种的分离方法，步骤如下：
[0011](1)采集虫草子实体及虫体，使用锡纸包裹采集样品放于采集盒中；在45℃烘箱中烘干，干燥后样品连同标签放入塑封袋保存；
[0012](2)采用组织分离法分离出采集样品的虫体内菌丝：利用流水冲洗新鲜虫体表面数次，除去表面泥土，再用75％酒精对虫体表面初步消毒；在无菌条件下，用刀片切开虫体表面，使用镊子尖端镊取虫体内部少许菌丝，并迅速接种于PDA固体培养基中，将培养基放置于28℃的培养箱中倒置培养，隔天观察一次，及时处理被杂菌污染的平板；菌丝初生长时，利用平板划线法将无污染的菌丝转接到新的PDA培养基中进一步培养；将纯化后的菌丝接种至PDA斜面试管中，置于
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20℃冰箱内保存。
[0013]一种上述虫草真菌新种的鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：
[0014](1)形态学鉴定：观察并详细记录虫草样品的宏观形态特征，包括子座长度，可育部颜色、形状、长度、直径，菌柄颜色、长度、直径，寄主类型，参照《中国大型菌物资源图鉴》初步鉴定至属或种；记录所分离出菌株的菌落特征，包括形态、颜色和质地；
[0015](2)分子鉴定：
[0016]a、提取虫草样品的基因组DNA；
[0017]b、以基因组DNA为模板PCR扩增ITS和TEF
‑
1序列；
[0018]c、PCR产物测序所得结果在SeqMan进行拼接，在GenBank中对拼接后的序列进行比对分析。所述PCR扩增的引物序列为：
[0019]引物名称引物序列ITS1
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F/ITS45＇
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CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
‑
3＇/5＇
‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
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3＇TEF1
‑
983F/TEF1
‑
2218R5＇
‑
GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT
‑
3＇/5＇
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种虫草真菌新种，其特征在于，所述虫草真菌新种为虫草菌(Cordyceps sp.)CH01，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2021年08月09日，保藏编号为：CGMCC No.23076。2.一种如权利要求1中所述虫草真菌新种的分离方法，其特征在于，步骤如下：(1)采集虫草子实体及虫体，使用锡纸包裹采集样品放于采集盒中；在45℃烘箱中烘干，干燥后样品连同标签放入塑封袋保存；(2)采用组织分离法分离出采集样品的虫体内菌丝：利用流水冲洗新鲜虫体表面数次，除去表面泥土，再用75％酒精对虫体表面初步消毒；在无菌条件下，用刀片切开虫体表面，使用镊子尖端镊取虫体内部少许菌丝，并迅速接种于PDA固体培养基中，将培养基放置于28℃的培养箱中倒置培养，隔天观察一次，及时处理被杂菌污染的平板；菌丝初生长时，利用平板划线法将无污染的菌丝转接到新的PDA培养基中进一步培养；将纯化后的菌丝接种至PDA斜面试管中，置于
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20℃冰箱内保存。3.一种如权利要求1中所述虫草真菌新种的鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)形态学鉴定：观察并详细记录虫草样品的宏观形态特征，包括子座长度，可育部颜色、形状...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗侠，
申请(专利权)人：滁州学院，
类型：发明
国别省市：