一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法技术

本发明专利技术提出了一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，包括如下步骤：步骤1、分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A，并分析细胞的染色体核型，以及免疫荧光鉴定肾脏特异性分子表达；步骤2、通过核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c－MYC四个转录因子表达载体TetO－FUW－OSKM与激活表达载体FUW－M2rtTA转入尿液肾脏细胞A中，得到尿液肾脏细胞B；步骤3、对尿液肾脏细胞B进行培养，在尿液肾脏细胞B的培养液中加入盐酸多西环素进行诱导，建立尿液细胞诱导多能干细胞系，并对细胞系的多潜能分子进行免疫荧光鉴定，借此，本发明专利技术具有能够分离急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞，并建立诱导多能干细胞的优点。并建立诱导多能干细胞的优点。并建立诱导多能干细胞的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法


[0001]本专利技术属于诱导多能干细胞的建立
，特别涉及一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法。

技术介绍

[0002]近几年，随着再生医学的发展，干细胞等相关技术在医疗领域中的研究与应用日益受到重视，而来源于成体细胞的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)系的建立，使得患者个体化医疗成为了可能，并为利用iPSCs救援肾损伤提供了新的思路。体外分离尿液细胞是目前非侵入性获得患者成体细胞的最佳途径。健康成人肾脏每天大约滤过100升体液，仅有2升随尿液正常排出，同时约2000－7000个脱落细胞存在于尿液中。而急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)后，肾脏则经历了早期的肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells，TECs)损伤破坏过程和后期修复过程，而患者临床表现为损伤早期的少尿或者无尿，以及恢复期的尿量增多，同时尿沉渣中出现上皮样细胞。
[0003]自Takahashi和Y本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A，并分析细胞的染色体核型，以及免疫荧光鉴定肾脏特异性分子表达；步骤2、通过核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c－MYC四个转录因子表达载体TetO－FUW－OSKM与激活表达载体FUW－M2rtTA转入尿液肾脏细胞A中，得到尿液肾脏细胞B；步骤3、采用白血病抑制因子结合碱性成纤维细胞生长因子的培养系，对尿液肾脏细胞B进行培养，在尿液肾脏细胞B的培养液中加入盐酸多西环素进行诱导，建立尿液细胞诱导多能干细胞系，并对细胞系的多潜能分子进行免疫荧光鉴定。2.根据权利要求1所述的一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤1中分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A的方法包括如下步骤：步骤100、利用无菌离心管收集急性肾损伤恢复期患者的晨尿30－50ml，于4℃低温存储；步骤101、于4℃对步骤1中存储的晨尿进行低温离心，离心后获得尿液细胞管型，该离心条件为800g，15min；步骤102、将尿液细胞管型接种于六孔培养板中，通过细胞培养液进行培养，培养24h后，将细胞培养液更换为尿液细胞培养液继续培养；步骤103、于每两天更换一次尿液细胞培养液，经过7－10天的培养时间后，得到尿液肾脏细胞A。3.根据权利要求1所述的一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤102中的细胞培养液由82％的高糖DMEM、15％的FBS及3％的Pen Strep组成；尿液细胞培养液由Knockout－DMEM、1％的ITS、200ng/ml的FGF9、50ng/ml的BMP7、0.1μmol/L的RA、1μg/ml的Heparin、10ng/m的EGF、10ng/m的activinA、300ng/ml的BMP4、15％的FBS和1％的Pen Strep组成。4.根据权利要求1所述的一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤1中分析细胞的染色体核型的方法包括如下步骤：步骤110、将尿液肾脏细胞A以1
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105接种于细胞培养平皿中，并于37℃，5％CO2的条件下进行恒温培养；步骤111、培养至细胞汇合度为70－90％后，向细胞培养平皿中的培养液中加入0.02μg/ml的秋水仙胺，继续培养1h后取出；步骤112、加入0.25％的胰酶进行消化，培养液终止消化后将细胞吹打成单个细胞，于1000rpm的条件下离心3min后弃上清液；步骤113、加入37℃预热的0.56％的KCL低渗液2ml，并轻轻吹打将细胞混匀，置于37℃的温度下水浴30min后，于1000rpm的条件下离心3min后弃上清液；步骤114、加入2ml的固定液后产生细胞沉淀，将细胞沉淀轻轻弹起后，再加入2ml的固定液，并将细胞吹匀，室温静置40min后，于1000rpm的条件下离心3min后弃上清液，再加入
2ml的固定液，并室温静置20min后，于1000rpm的条件下离心3min后弃上清液，剩余的部分即为待测样，其中固定液为甲醇和冰醋酸的混合物，甲醇和冰醋酸的混合体积比为3：1；步骤115、将待测样的细胞吹匀，在70－80cm距离处将细胞滴到载玻片上，室温放置过夜后，按照Giemsa：水＝1：10的比例配制染色液并染色20min，之后将染色液用水冲洗，室温放置待水分蒸干后，油镜下观察待测样的细胞核型。5.根据权利要求1所述的一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤1中免疫荧光鉴定肾脏特异性分子表达的方法包括如下步骤：步骤120、将尿液肾脏细胞以1
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104/孔接种于二十四孔细胞培养板中，并于37℃，5％CO2的条件下恒温培养；步骤121、培养24h后，弃掉细胞培养板中的培养液，用PBS清洗一次，清洗时间为5min，并通过4％的多聚甲醛固定10min后，再次用PBS清洗三次，每次的清洗时间为5min，并通过1％的Triton室温通透1h后，再次用PBS清洗三次，每次的清洗时间为5min；步骤122、清洗结束后，使用10％的山羊血清室温封闭1h，之后移除封闭液，加入蛋白的一抗，于4℃过夜放置，一抗和10％山羊血清的比例为1：200；步骤123、过夜放置后，移除一抗，并用PBS清洗三次，每次的清洗时间为5min后，避光加入二抗，室温避光孵育1h后，移除二抗，向细胞中加入Fluoroshield
TM
withDAPI，于荧光显微镜下观察染色结果，二抗和10％山羊血清的比例为1：1000。6.根据权利要求1所述的一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，其特征在于，所述步骤2中通过核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c－MYC四个转录因子表达载体TetO－FUW－OSKM与激活表达载体FUW－M2rtTA转入尿液肾脏细胞A中的方法包括如下步骤：步骤20、...

【专利技术属性】
技术研发人员：金永，张曼玲，李荣凤，曹长春，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：