一类雌激素相关受体β突变体及其应用制造技术

一类雌激素相关受体β突变体及其应用，涉及基因工程和蛋白质工程。所述一类雌激素相关受体β突变体由SEQ ID No.1所示的人源ERRβ氨基酸序列比对后，配体结合域螺旋1于突变位点相应位置的酪氨酸突变为组氨酸获得。采取基于分子生物学技术提高ERRβ体外表达蛋白的溶解性和稳定性，并保持原有蛋白功能性。突变体质粒经表达、纯化后可以得到大量且稳定的突变体蛋白，同时具备正常的配体和辅调节因子结合及转导下游信号的功能，为研究ERRβ提供了蛋白质工具，可用于靶向药物筛选、抗体制备、蛋白-药物生理药理学参数检测、蛋白-蛋白相互作用以及结构生物学研究等各个领域。用以及结构生物学研究等各个领域。用以及结构生物学研究等各个领域。

【技术实现步骤摘要】
一类雌激素相关受体
β
突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程，尤其是涉及一类雌激素相关受体β突变体及其应用。

技术介绍

[0002]蛋白质是生命的物质基础，机体所有重要的组成部分和生命活动都需要有蛋白质的参与。从生物材料中分离、制备蛋白质，并研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。外源重组蛋白的制备可以应用基因重组技术，从获得带有目的蛋白的基因片段的重组载体开始，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞，进而在特定条件下诱导宿主细胞表达特定的重组蛋白。重组蛋白在工业生产和研究中都有广泛的应用：工业生产的蛋白酶制剂；医疗上用猪胰岛素来治疗糖尿病及体外诊断靶点；药物研究中对靶点蛋白进行体外药物筛选和受体-药物生物学与药理学特性研究；其它研究如蛋白质结构的测定和蛋白抗体的制备等。
[0003]重组蛋白表达纯化的工艺优化需要在保留蛋白质活性的前提下提高蛋白稳定性和可溶性。根据对蛋白质结构和功能的分析，可以通过定点突变的方式设计改变修饰，以提高蛋白质稳定性、酶活性及可溶性等。定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等，最终改变DNA所表达的目的蛋白的性状及表征。
[0004]核受体是全球药物研发的重要靶蛋白，在人类发育分化和代谢稳态等基本生命活动的调节中发挥着广泛且深远的影响(Santos et al.,Nat Rev Drug Discov,2017,16(1),19-34.)；其超家族成员包括内分泌介导类固醇激素、甲状腺激素、脂溶性维生素A和D作用的受体，以及大量内源配体未知的孤儿核受体。
[0005]作为一种孤儿核受体，雌激素相关受体ERRs(estrogen-related receptors)在人类基因组中存在三种亚型，包括ERRα、ERRβ和ERRγ(Eudy JD et al.,Genomic,1998,50(3):382-384)。ERRs参与机体的代谢调节、细胞周期以及内稳态的维持等重要生理活动，与酒精性脂肪肝、炎症性骨质疏松、胰岛素抵抗、癌症等多种疾病息息相关，是一个极具价值的药物研究靶点。与经典核受体结构组成相似，ERRs有五个主要的功能域：可变的N端域(NTD)、高度保守的DNA结合域(DBD)、配体结合域(LBD)、DBD与LBD间的铰链域(Hinge)及C端延伸域(CTD)。
[0006]雌激素相关受体ERRs是自激活蛋白，即在没有配体结合的情况下，ERRs处于激活构象，与辅激活因子结合，能够促进下游基因的转录。除此之外，ERRs的配体结合域(LBD)还可以与不同的配体结合，进而发生构象变化，募集多种辅调节因子，包括辅激活因子和辅抑制因子，最终达到调节靶基因转录水平的目的。激活剂类配体能使ERRs募集SRC1、SRC2、SRC3、PGC-1α、Trap220等多种辅激活因子，而拮抗剂类配体则促使ERRs与NCoR等辅抑制因子结合。通过差异性募集辅调节因子，导致不同配体差异性调节靶基因的表达水平，并最终调节机体的生理功能。
[0007]研究表明，ERRβ分布广泛并参与调控多种重要的生理功能。在胚胎时期，ERRβ高丰度表达可以促进胚胎发育，出生后则广泛分布于心、肾、前列腺和中枢神经等部位调节细胞周期及内稳态。ERRβ基因敲除小鼠体重减轻，脂肪量减少，代谢活性和能源消耗增加，提示ERRβ与能量内环境稳态的维持密切相关。此外，与ERRγ相似，ERRβ还具备调节细胞增殖周期、诱导胚胎和多能干细胞重编程的能力。这一特殊的能力，使其成为癌症相关疾病治疗的新热靶点。同时，在多氯联苯(PCB)、双酚A(BPA)等环境污染物对动物和人类造成的不良影响事件中，ERRβ亦扮演重要角色。
[0008]然而，难以获得溶解度高且稳定的ERRβ LBD蛋白质，一直是阻碍ERRβ靶点药物研究的瓶颈之一。在ERRs三个亚型中，ERRγ和ERRα的LBD因为良好的体外表达溶解性和稳定性，早在十多年前就成功实现体外纯化并凭借高效、廉价的生物化学平台进行了广泛的药物研究(Audet-Walsh et al.,ActaPharmacologicaSinica,2015,36(1):51-61)。因为体外难以获取高纯度的蛋白，ERRβ参与的蛋白生化研究、大规模体外药物筛选、受体-药物生物学与药理学特性研究进程显著落后于ERRα和γ。
[0009]随着蛋白质工程和分子生物学技术的发展，运用理性设计和定向突变手段对蛋白质分子进行人工化改造已成为当前解决蛋白质工程领域问题的基础方法。通过与高同源性可溶蛋白质之间进行序列和结构比对，可以帮助识别导致溶解度低或聚合问题的关键残基，如识别糖皮质激素受体的F602S突变和盐皮质激素受体的C808S突变(Bledsoe et al.,Cell,2002,110,93-105；Li,Y.et al.,Mol Cell,2015,19,367-380)。半胱氨酸残基通常被优先用于系统性突变，以避免由于二硫键的形成引起的蛋白质的错误折叠和聚集。需要注意的是，要严格确保突变不会改变蛋白质的原有功能。具体到本专利技术的核受体时，需要确保突变残基引入LBDs的情况下，配体结合口袋和辅调节因子结合位点不受到突变的干扰。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供运用理性设计和定向突变手段构建的一类雌激素相关受体β突变体及其应用。
[0011]所述一类雌激素相关受体β突变体由SEQIDNo.1所示的人源ERRβ氨基酸序列比对后，配体结合域螺旋1于突变位点相应位置的酪氨酸突变为组氨酸获得。
[0012]所述ERRβ相应位置的酪氨酸突变为组氨酸后的突变体，包括全长或含有该突变位点的部分功能域蛋白，其中含该突变位点的全长人源氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述ERRβ氨基酸序列为不同种属或同源异构体。
[0013]所述突变位点可为多位点组合，包括但不限于Y215H、E234D、R382H、Y356H、Q416E等中的至少一个。
[0014]所述ERRβ蛋白包括全长或含有螺旋1上酪氨酸的部分功能域蛋白。
[0015]所述雌激素相关受体β突变体蛋白通过原核表达系统体外表达，所述原核表达系统包括但不限于大肠杆菌表达系统。
[0016]所述一类雌激素相关受体β突变体蛋白可在ERR配体及靶向药物筛选、蛋白结晶研究、抗体制备、蛋白-药物生理药理学参数检测及蛋白-蛋白相互作用以及结构生物学研究等中的应用。
[0017]所述一类雌激素相关受体β突变体质粒经表达、纯化后可以得到大量且稳定的突
变体蛋白，同时具备正常的配体和辅调节因子结合及转导下游信号的功能，为研究ERRβ提供了蛋白质工具，可以用于靶向药物筛选、抗体制备、蛋白-药物生理药理学参数检测、蛋白-蛋白相互作用以及结构生物学研究等各个领域。
[0018]实验证明，ERRβ突变体质粒表达的蛋白与野生型相比有溶解性提高或稳定性提高或溶解性和稳定性均提高的特性。蛋白表达及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一类雌激素相关受体β突变体，其特征在于由SEQ ID No.1所示的人源ERRβ氨基酸序列比对后，配体结合域螺旋1于突变位点相应位置的酪氨酸突变为组氨酸获得。2.如权利要求1所述一类雌激素相关受体β突变体，其特征在于所述相应位置的酪氨酸突变为组氨酸后的突变体，包括全长或含有该突变位点的部分功能域蛋白，其中含该突变位点的全长人源氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.如权利要求1所述一类雌激素相关受体β突变体，其特征在于所述ERRβ氨基酸序列为不同种属或同源异构体。4.如权利要求1所述一类雌激素相关受体β突...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，姚本强，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：