循环肿瘤细胞苏木素-伊红染色装置以及苏木素-伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置制造方法及图纸

本实用新型专利技术涉及医学病理检验和细胞分子生物学技术领域，具体公开了循环肿瘤细胞苏木素

【技术实现步骤摘要】
循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置以及苏木素
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伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置


[0001]本技术涉及医学病理检验和细胞分子生物学
，具体涉及循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置以及苏木素
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伊红染色和微量核酸提取、浓缩装置。

技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是1896年TRAshworth在对患癌病人尸体解剖时通过观察病人的血液发现的与体内相同肿瘤的血液肿瘤细胞。目前CTC检测仍存在病理专业对接断裂缝隙，CTC被普遍认为是必然进入医院肿瘤常规检诊的病理检验或实验中心科细胞苏木素
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伊红染色(HE)形态诊断项目，应该由病理HE 常规技术代替非HE染色才能进行病理形态诊断，应由医学病理医师签发诊断报告。
[0003]虽然基因组技术近十年来的发展突飞猛进，但现有CTC生物产品技术在临床病理科常规诊断技术中的应用十分薄弱。病理HE染色诊断专业技术作为目前唯一的医学病理诊断的核心技术，是医学肿瘤诊断不可或缺的技术。然而，现有技术一般仍采用FISH荧光杂交和模糊的DAPI染色信号判断CTC的标志物阳性或阴性，例如：美国强生公司使用Cell search仪器用上皮细胞抗体荧光标记技术对循环中的乳腺癌上皮样肿瘤细胞进行染色；专利申请CN201710568652.9使用磁珠、 3
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4种抗体、微流体吸附等组合设备，然后仍然是进行荧光原位杂交在荧光显微镜下观察。其他如叶酸标记技术、全自动微流体芯片 (CytoChipNano)、密度梯度离心技术等，都是对CTC细胞进行荧光原位杂交染色，而且叶酸酶对时间性要求高，容易失活和降低杂交效率，只能获取不足30％的CTC癌细胞，不能全部捕获肿瘤细胞，因此存在假阴性问题。
[0004]荧光杂交标志物染色技术中，CTC的检测图像是在载玻片平面的 CTC细胞区域获取荧光原位杂交信号，必须在荧光显微镜暗视野观察点状荧光信号，而无法反映肿瘤细胞全面的核浆形态，因此，荧光杂交标志物染色技术无法满足病理学常规染色诊断技术的要求。此外，武汉某医疗科技股份有限公司使用负压条件下的膜过滤单一技术获取恶性肿瘤细胞，可以进行快速直接单一的亚甲蓝或吉姆萨或DAPI 染色，同时封片观察，但该方法仅能够观察血液细胞模糊蓝色细胞核影像，仅供检验科观察，不能用于病理科肿瘤细胞诊断的核浆染色。目前尚未有CTC病理HE形态诊断产品进入医院常规应用，这形成了生物和医学两领域间转化应用的现实平台裂缝，遏制了生物新技术在临床医学的应用推广。
[0005]另一方面，临床和病理检查亟需将CTC进行核酸提取和后续的基因测序和染色体及拷贝量变异检测。但是由于肿瘤患者血液往往仅能够提取到个位数的CTC，全部无损耗提取核酸也仅有100ng左右的微量核酸总量。而且，在市售核酸试剂盒常规提取流程中，通常需要不断地在每个步骤间转移试管，原本罕少的极低浓度核酸在多次更换试管管壁上的滞留，会导致核酸总量降低至检出阈值以下。这些都使得 CTC核酸提取的技术难度很大。已有文献报道CTC能提供的DNA量太少若不经浓缩则无法获得足够的DNA进行下游基因实验(Takeda K, Yamada T,Takahashi G,et al.Analysis of colorectal cancer
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related
mutations by liquid biopsy:Utility of circulating cell
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free DNA andcirculating tumor cells[J].Cancer Science,2019.)。目前临床上只能实现 CTC的细胞学形态检测，尚未实现后续核酸提取和基因检测的稳定进行。
[0006]关于CTC的核酸提取，绝大部分现有技术均是针对非纯净CTC细胞提取核酸。尚未见对HE染色的循环肿瘤细胞进行微量核酸提取的同步技术，更没有通过浓缩CTC微量核酸达到检测最低标准总核酸量 (NGS，200ng以上；全基因组，60ng以上)以便开展稳定性的医学检测。
[0007]研究人员采用QIAGEN的REPLI
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g系列全基因组/转录组扩增试剂盒，对单个癌细胞通过基因随机引物扩增获得了满足实验使用的基因组，但其也不是针对病人的CTC细胞。另有不提取CTC、而是使用标签DNA掺入血液中未知CTC核酸基因组内，然后基于实时定量PCR (Q
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PCR)模糊检测CTC的方法。上述所有方法都是湿性实验，必须抽血后立即检测，最多不能超过3小时，否则难以获得检测结果。
[0008]此外，Cell search技术是将检出的CTC细胞分布到玻片上进行荧光原位杂交基因的干实验，并不回收CTC细胞进行后续基因组靶向药物等湿实验。珠海某公司富集分离仪是收购了美国Cynvenio公司， CTC富集技术特点是在同一份血样中获得CTC、ctDNA和白细胞三份样本，后续可应用于荧光原位杂交实验基因检测，但不能用于基因测序和芯片，而且漏检率也较高，另外与Cellsearch技术的缺陷相同，该技术对于占肿瘤70％的非Her2、非CKs阳性的细胞也会漏检，更重要的是其也是使用荧光显微镜原位杂交显示CTC的荧光标志，而不是 HE染色光镜观察CTC细胞核浆本身，没有HE染色诊断报告。
[0009]目前，提取滤膜上的高纯CTC的核酸干性实验还没有稳定成功，在湿性试管液体环境依靠梯度离心分层或抗体或探针获得的所谓 CTC样本混有超过其7倍数量的中性粒细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和较原始造血细胞等，是正常人体的二倍体核酸，再采取湿性实验提取极其微量的CTC核酸，导致CTC的肿瘤纯DNA占比在混合DNA 中占25％以下，后续测序检测出真实CTC基因组数据难度很大。
[0010]文献报道液体活检提取CTC的DNA的湿性实验方法不只是CTC，还混有非单纯的CTC产物，如细胞游离DNA(cfDNA)、细胞游离RNA (cfRNA)、microRNA(miRNA)和外泌体(Taja,Lozar,Klara,et al.Thebiology and clinical potential of circulating tumor cells.[J].Radiologyand oncology,2019,53(2):131
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147.)，用于病人诊疗检测存在明显缺陷。
[0011]专利申请CN201611017879.6利用商业试剂盒德国Geriner公司的产品Oncoquick进行细胞密度梯度分离液，采取多孔隔膜分离管分别提取血液ctDNA和有核细胞，即白细胞和肿瘤细胞混合物，未特异提取循环肿瘤细胞，且容积高达15ml；其记载的提取到的该细胞层为“目的细胞层”，而不是单纯的循环肿瘤细胞，其中混有更多量的是粒细胞，淋巴细胞，单核细胞等，仅有少量循环肿瘤细胞，其实验结果也证明所谓的循环肿瘤细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置，其特征在于，包括：细胞小室(7)，所述细胞小室(7)上方开口，且底面为有机材料膜，用于截留循环肿瘤细胞并滤过染色试剂；滤膜(8)，所述滤膜可操作地设置在所述细胞小室(7)中，用于截留循环肿瘤细胞；细胞井(6)，所述细胞井(6)上方开口，用于收集所述细胞小室(7)的滤过液；所述细胞小室(7)可操作地悬挂于所述细胞井(6)的内壁中。2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置，其特征在于，所述细胞小室(7)的底面与所述细胞井(6)的底面之间留有储存滤过液的空间。3.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置，其特征在于，所述滤膜为滤孔直径为6
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8μm的PE膜。4.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置，其特征在于，所述有机材料膜的滤孔直径为0.2
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0.4μm。5.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色装置，其特征在于，所述装置还包括载玻片(9)和镊子(10)，所述载玻片(9)用于支持光学正置显微镜观察，所述镊子(10)用于提起所述细胞小室(7)或所述滤膜(8)。6.循环肿瘤细胞苏木素
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伊红染色和微...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖仁胜，白玲，徐传彬，王君凯，沈洪波，邓文海，王远宁，姜丽红，王燕，奎翔，赵龙，
申请(专利权)人：江苏基智诊疗有限公司，
类型：新型
国别省市：