去除同种或异种生物材料的免疫原性的方法技术

本发明专利技术涉及医药材料领域，特别涉及去除同种或异种生物材料的免疫原性的方法。本发明专利技术采用洗涤剂和酶结合的方法，充分利用新型洗涤剂的破膜和溶解蛋白的优势，同时利用核酶的特异性分解作用，有效去除细胞成分和细胞外基质抗原物质。达到时间短，去除免疫原性效果好的优势。势。

【技术实现步骤摘要】
去除同种或异种生物材料的免疫原性的方法


[0001]本专利技术涉及医药材料领域，特别涉及去除同种或异种生物材料的免疫原性的方法。

技术介绍

[0002]心脏瓣膜疾病是一种具有高发病率及高致死率的疾病，全世界范围内心脏瓣膜疾病率随着老年化的日益加重，正逐年攀升，已成为世界范围内危及生命的主要医疗保健问题之一。晚期瓣膜性疾病导致丧失自我修复功能，瓣膜置换术成为唯一的手术选择。全世界每年进行近30万例瓣膜置换手术，预计到2050年这个数字将增加两倍。目前人造心脏瓣膜主要由机械心脏瓣膜和生物假体心脏瓣膜两大类型组成，并已广泛应用了几十年。两种人造瓣膜各有优缺点；机械瓣膜耐久高，可以达到二十年以上，但是其容易形成血栓，需要终生抗凝。而生物心脏瓣膜由于其较机械瓣膜有更低的血栓形成性，从而避免了终生抗凝的需要，并且能表现出与天然瓣膜相似的优良的血流动力学特性而越来越多地被临床采用，但是生物心脏的耐久性较差，使用寿命只有10
‑
15年，导致患者需承受再次开胸手术的痛苦。
[0003]生物心脏瓣膜耐久性较差的原因与生物瓣膜的免疫原性相关。由于生物瓣膜材料属于异种组织材料，不可避免的会有免疫原性，从而发生排斥反应。为了掩盖组织抗原性，异种组织瓣膜在植入前都要经过戊二醛固定。然而戊二醛存在众所周知的缺点，残存的戊二醛显示出阻止宿主细胞附着、迁移和增殖的细胞毒性作用从而增加钙化和组织疲劳的风险；此外戊二醛交联过后的生物瓣膜材料无法在体内生长和重塑，限制了其进一步的临床应用。如年轻人或者小孩随着生长，需要多次置换瓣膜，导致生活质量的严重下降。最近的研究表明，戊二醛固定后的抗原性掩盖是不完全的，会导致慢性移植物特异性免疫反应，从而限制了瓣膜的寿命。
[0004]来自异种组织的细胞往往被机体视为外来物，从而发生免疫排斥反应攻击外来细胞，导致细胞的失活和死亡，从而导致组织瓣膜的钙化和衰败。为了防止生物瓣膜的钙化和衰败，脱细胞化已被提出作为一种降低组织抗原性的方法，从而获得更好的组织相容性、重塑和长期持久性。
[0005]目前生物瓣膜的细胞去除方案，主要包括物理方法(如通过低渗和高渗反复交替、反复冻融、冷冻干燥、超高压等)、化学方法(高浓度的离子、非离子、两性离子洗涤剂(Triton X
‑
100(曲那通X
‑
100)，十二烷基硫酸钠(SDS)、3
‑
[(3
‑
胆酰胺丙基)二甲基氨基]‑1‑
丙磺酸盐(CHAPs)等)和酶的方法(胰蛋白酶和核酸酶(DNAse和RNAse)等)脱去细胞。
[0006]目前国内外运用得最广的是洗涤剂加上酶法进行脱细胞，其中两性离子洗涤剂(Triton X
‑
100(曲那通X
‑
100)，十二烷基硫酸钠(SDS)运用最广。
[0007]虽然国内外有多种免疫原性去除的方法，但仍存在一些问题：(1)相应的化学试剂可引起细胞外基质三维结构的破坏，对脱细胞组织的力学性能有负面影响；(2)目前的处理方法无法满足生物瓣膜免疫原性去除的要求，残留的碱基以及细胞外基质抗原依然会引起
免疫反应；(3)其相应的处理时间持续较长，特别是单一或者仅两者方法结合的，其处理过程均在一周以上。
[0008]因此，如何快速高效的去除异种生物瓣膜的细胞成分及免疫原性，维持异种生物瓣膜完整的细胞外基质结构，并保证其良好的生物力学性能，具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术采用新型两性离子去污剂烷基聚氧乙烯醚硫酸钠(AES)进行生物瓣膜的免疫原性去除处理。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]本专利技术提供的去除同种或异种生物材料的免疫原性的方法，包括如下步骤：
[0012]步骤1：取同种或异种生物材料经第一漂洗后，与杀菌剂混合，获得杀菌后的生物材料；
[0013]步骤2：取步骤1制得的所述杀菌后的生物材料与洗涤剂混合，经第二漂洗后再分别经DNA酶和RNA酶处理，经第三漂洗，保存，灭菌；
[0014]所述洗涤剂包括AES。
[0015]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述杀菌剂包括新洁尔灭。
[0016]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述杀菌剂的浓度为0.1％。
[0017]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述洗涤剂包括含抗生素的PBS配制的3％AES；所述杀菌后的生物材料与所述洗涤剂的质量体积比为1:5；所述抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/ml；所述链霉素的浓度包括100μg/ml。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2所述混合具体为：于37℃下处理24h，每12h换液一次。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2中所述DNA酶的浓度包括2～3U/ml；所述RNA酶的浓度包括0.02～0.03mg/ml，所述RNA酶还包括2.5mM的Mg
2+
和0.1mM的Ca
2+
。
[0020]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2中所述处理具体为：37℃震荡处理24h，每12h换液一次。
[0021]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1或步骤2中的所述漂洗采用的漂洗剂包括抗生素无菌PBS液或无菌蒸馏水，所述抗生素无菌PBS液中抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/ml；所述链霉素的浓度包括100μg/ml；
[0022]所述第一漂洗的次数至少为3次，每次10min；
[0023]所述第二漂洗的次数至少为3次，每次10min，漂洗的同时摇动洗去残余的AES；
[0024]所述第三漂洗具体为：25℃
±
5℃下漂洗24h，每8h换液一次。
[0025]基于上述研究，本专利技术还提供了所述的方法制得的同种或异种生物材料。
[0026]本专利技术还提供了所述的同种或异种生物材料在制备治疗疾病的生物材料中的应用。
[0027]本专利技术采用洗涤剂和酶结合的方法，充分利用新型洗涤剂的破膜和溶解蛋白的优势，同时利用核酶的特异性分解作用，有效去除细胞成分和细胞外基质抗原物质。达到时间短，去除免疫原性效果好的优势。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029]图1示AES处理后的HE染色结果；
[0030]图2示TritonX
‑
100处理后的HE染色结果；
[0031]图3示DNA含量检测结果；
[0032]图4示通过新型去污剂AES对牛心包的免疫原性去除率；
[0033]图5示通过TritonX
‑
100对牛心包的免疫原性去除率；
[0034]图6示厚度的检测结果；
[0035]图7示弹性模量的检测结果；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.去除同种或异种生物材料的免疫原性的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取同种或异种生物材料经第一漂洗后，与杀菌剂混合，获得杀菌后的生物材料；步骤2：取步骤1制得的所述杀菌后的生物材料与洗涤剂混合，经第二漂洗后再分别经DNA酶和RNA酶处理，经第三漂洗，保存，灭菌；所述洗涤剂包括AES。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂包括新洁尔灭。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂的浓度为0.1％。4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂包括含抗生素的PBS配制的3％AES；所述杀菌后的生物材料与所述洗涤剂的质量体积比为1:5；所述抗生素包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度包括100U/ml；所述链霉素的浓度包括100μg/ml。5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2所述混合具体为：于37℃下处理24h，每12h换液一次。6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中所述DNA酶的浓度包括2～3U/ml；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋明哲，刘育宏，吴忠仕，唐贞洁，齐晓科，姜振林，解鑫隆，吴其应，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：