RubiconRUN结构域的苏氨酸166和丝氨酸189作为LRRK2激酶抑制靶点制造技术

使用抗体检测Rubicon蛋白的苏氨酸166和/或丝氨酸189的磷酸化以鉴定患有与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病的受试者的方法，例如帕金森病。还公开了使用抑制剂阻断LRRK2与Rubicon蛋白的苏氨酸166和/或丝氨酸189相互作用的方法。互作用的方法。互作用的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】Rubicon RUN结构域的苏氨酸166和丝氨酸189作为LRRK2激酶抑制靶点
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2019年3月7日提交的新加坡专利申请号10201902046S 的优先权，其内容通过引用并入本文。


[0003]本专利技术一般涉及用于诊断和/或提供治疗与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病，特别是诊断和/或提供治疗帕金森病(PD)的方法、抗体、抑制剂和试剂盒。

技术介绍

[0005]以下对本专利技术背景的讨论旨在促进对本专利技术的理解。应当理解，该讨论不是确认或承认在本专利技术的优先权日期所提及的任何材料，已在任何司法管辖区出版、已知或属于本领域技术人员的公知常识的一部分。
[0006]富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。LRRK2突变与帕金森病(PD)、慢性炎症，如克罗恩病和分枝杆菌感染有关。LRRK2突变是常染色体显性和散发性PD的最常见原因，在某些人群中占PD病例的40％。 G2019S是最普遍的LRRK2突变体，据报道与野生型LRRK2相比，其激酶活性增强。亚洲LRRK2变体如N551K、R1398H、R1628P和G2385R已被报道，但突变的功能影响尚不清楚，因为这些变体尚未被完全描述。家族性 LRRK2相关PD与特发性PD有很大的重叠，这表明阐明LRRK2功能可能会提供对家族性和特发性PD的见解。尽管LRRK2相关毒性与其激酶功能有关，但由于缺乏真正的LRRK2底物，其生理功能仍然未知。因此，对LRRK2 底物的探索和LRRK2激酶抑制剂的开发引起了人们的兴趣，因为它们可能引导对LRRK2相关疾病(如PD)的治疗干预。
[0007]PD是一种中枢神经系统的长期退行性疾病，主要影响运动系统。PD是一种全球性疾病，无法治愈，治疗主要针对改善症状。迄今为止，还没有诊断分析来帮助PD的临床诊断。当前的PD临床诊断依赖于运动症状和脑部扫描。
[0008]作为Beclin
‑
1相互作用和富含半胱氨酸的RUN结构域蛋白(Rubicon)是一种已知参与自噬、吞噬作用和免疫反应的蛋白质。
[0009]在诊断和/或提供帕金森病治疗方面，至少需要减轻一些困难。

技术实现思路

[0011]可以预见，描述的方法、抗体、抑制剂和试剂盒将用于诊断和/或提供治疗与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病，特别是诊断和/或提供治疗帕金森病(PD)。
[0012]相应地，本专利技术的一个方面提供了一种检测Rubicon蛋白磷酸化的体外方法，包括：从样品中分离蛋白质；将分离的蛋白质与抗体接触，该抗体与Rubicon 蛋白的166位处的磷酸化苏氨酸杂交以形成复合物；检测所述复合物，其中检测到与预定值不同的复合物表明样品来自患有与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2) 相关的疾病的受试者。
[0013]本专利技术的另一方面提供了一种能够结合在苏氨酸166位磷酸化的Rubicon 的抗体。
[0014]本专利技术另一方面提供了一种如上文所描述的抗体，用于诊断或治疗与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病。
[0015]本专利技术的另一方面提供了一种Rubicon与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相互作用的抑制剂，其包含一种能够阻断LRRK2与Rubicon蛋白的苏氨酸166相互作用的化合物。
[0016]本专利技术的另一方面提供了一种如上文所描述的抑制剂，用于治疗与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病。
[0017]本专利技术另一方面提供了一种如上文所描述的抗体或如上文所描述的抑制剂，在制备用于治疗与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病的药物中的用途。
[0018]本专利技术的另一方面提供了治疗有患有与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病的需要的受试者的方法，包括：施用能够阻断LRRK2与Rubicon蛋白的苏氨酸166和/或丝氨酸189相互作用的化合物。
[0019]本专利技术的另一方面提供了一种试剂盒，其包含上文所描述的抗体或上文所描述的抑制剂，以及用于检测与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病的检测试剂。
[0020]结合附图阅读以下对本专利技术具体实施例的描述后，本专利技术的其他方面和特征对本领域普通技术人员将变得显而易见。
[0021]附图简要说明
[0022]在仅通过非限制性示例的方式说明的附图中，本专利技术的实施例可包括，
[0023]图1.LRRK2和Rubicon相互作用。(a)LRRK2和Rubicon在尸检 (post
‑
mortem)的人PD大脑中的共定位。对尸检的人黑质脑组织进行内源性 LRRK2和Rubicon表达染色。Imaris软件分析共聚焦图像以生成2D直方图和共定位统计数据(表1)。(b)LRRK2和Rubicon的免疫共沉淀。用过度表达人LRRK2
‑
GFP和/或Rubicon
‑
Flag的HEK裂解物进行免疫共沉淀。
[0024]图2.LRRK2特异性Rubicon磷酸化位点(phosphosite)的鉴定。野生型或突变型LRRK2激酶测定以野生型或无磷突变体Rubicon作为底物进行。所得磷酸化Rubicon信号以条形图的形式制成表格，并使用针对野生型Rubicon 的学生t检验(Student
’
s t
‑
test)计算统计显着性。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
[0025]图3.LRRK2特异性Rubicon磷酸化位点的验证。(a)使用野生型或无磷突变体Rubicon作为底物进行LRRK2 ADP激酶测定，测量激酶反应生成的ADP。使用针对野生型Rubicon的学生t检验计算统计显着性；*p<0.05。(b)使用ELISA分析内源性LRRK2敲低或过表达LRRK2的人神经元细胞的内源性 pT166 Rubicon表达。使用学生t检验针对对照计算统计显着性，且*p<0.05, **p<0.01。
[0026]图4.果蝇攀爬试验和寿命研究。评估过表达人类LRRK2
±
Rubicon的果蝇的攀爬能力和寿命。每10天进行一次攀爬试验，直到第60天，并将得到的攀爬指数制成表格。寿命研究每7天记录一次，直到所有苍蝇都死亡。每条果蝇线的最后一天都标在条形图上方。使用多重比较与Tukey
‑
Kramer事后检验进行统计分析。*p<0.05,***p<0.001(表2和3)。
[0027]图5.果蝇酪氨酸羟化酶(TH)表达。年老的转基因果苍蝇大脑在五个区域 (PPL1、PPL2、PPM1/2、PPM3、PAL)中被染色为TH阳性神经元簇并计数。结果计数制成表格，并在调整多重比较后使用学生t检验分析统计显着性(表 4)。
[0028]图6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测Rubicon蛋白磷酸化的体外方法，包括：从样品中分离蛋白质；将分离的蛋白质与抗体接触，该抗体与Rubicon蛋白的166位处的磷酸化苏氨酸杂交以形成复合物；检测所述复合物，其中检测到与预定值不同的复合物表明样品来自患有与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病的受试者。2.如权利要求1所述的体外方法，其特征在于，所述与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关的疾病是帕金森病。3.如权利要求3所述的体外方法，其特征在于，所述抗体是一种嵌合人源化抗体。4.如权利要求3所述的体外方法，其特征在于，所述抗体是一种单克隆抗体。5.如前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述复合物用酶联免疫吸附试验检测。6.如前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)相关疾病的受试者用一种能够阻断LRRK2与所述Rubicon蛋白的苏氨酸166和/或丝氨酸189相互作用的化合物治疗。7.如前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述化合物包含一种治疗抗体。8.如权利要求7所述的体外方法，其特征在于，所述治疗抗体是一种嵌合人源化抗体。9.如权利要求7所述的体外方法，其特征在于，所述治疗抗体是一种单克隆抗体。10.如前述权利要求中任一项所述的体外方法，其特征在于，进一步包括在所述分离的蛋白质与所述抗体接触之前去除封闭蛋白。11.如权利要求10所述的体外方法，其特征在于，所述封闭蛋白包括白蛋白。12.一种能够与在苏氨酸166位磷酸化和/或在丝氨酸189位磷酸化的Rubicon结合的抗体。13.如权利要求12所述的抗体，包含至少一个可变区，所述可变区并入选自氨基酸序列i)至vi)的CDR：i)LC
‑
CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO.4)；ii)LC
‑
CDR2:KLSNRFS(SEQ ID NO.5)；iii)LC
‑
CDR3:SQSTHVPLT(SEQ ID NO.6)；iv)HC
‑
CDR1:NYGVS(SEQ ID NO.7)；v)HC
‑
CDR2:TINSNGGSKYYPDSVKG(SEQ ID NO.8)；vi)HC
‑
CDR3:DVWLRRQWYFDV(SEQ ID NO.9)；和与氨基酸序列i)至vi)中的任一个具有99％氨基酸序列同一性的功能性变体。14.如权利要求12所述的抗体，包含氨基酸序列：i)LC
‑
CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO.4)；ii)LC
‑
CDR2:KLSNRFS(SEQ ID NO.5)；iii)LC
‑
CDR3:SQSTHVPLT(SEQ ID NO.6)；iv)HC

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽玲，陈永庆，
申请(专利权)人：新加坡保健服务集团有限公司，
类型：发明
国别省市：