一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途；所述生物活性物质组合物用于无血清培养基和/或组合物及其制备；所述的无血清培养基和/或组合物可用于细胞和/或组织的原代培养和传代培养。所述细胞选自肌腱和/或韧带来源细胞、软骨细胞、半月板干细胞、间充质干细胞、骨骼干细胞、肌肉干细胞中任意一种或多种细胞。所述组织为运动系统来源组织。所述的生物活性物质组合物和/或无血清培养基和/或组合物可用于制备组织和/或器官损伤治疗药物；所述的组织或器官损伤选自运动系统组织或器官损伤。损伤选自运动系统组织或器官损伤。损伤选自运动系统组织或器官损伤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体地涉及一种由生物活性物质制得的无血清培养基及应用。

技术介绍

[0002]世界卫生组织数据显示组织器官损伤是第2位的致残因素和重要健康问题。由于工业、农业、交通业及体育事业的高速发展，各种事故所造成的创伤日趋增多，2008年,国家统计局公布的数据显示创伤与中毒是第5位致死疾病。随着社会经济发展，交通和城市建设的加快，运动损伤、交通事故、自然灾害(如汶川、玉树特大地震)、工伤事故(如天津港爆炸事故，福建漳州PX工厂爆炸)等所引起的人体组织的损害发生率大幅增加。且由于严重创伤发生的人群主要为青壮年,其导致的社会生产力损失显得尤为严重。同时伴随着衰老，人体的组织和器官再生修复能力下降，导致各种疾病的发生。由此，如何快速有效的修复损伤组织已成为一个迫切需要解决的制约社会、经济发展的重大健康问题。
[0003]近年来，细胞治疗、组织工程技术与分子生物学技术的发展为提高组织的修复质量带来了新的机遇，研究者开始尝试采用组织工程技术和细胞治疗来治疗和修复组织缺损。而获得理想的种子细胞是组织修复再生的关键。常见的用于细胞治疗的细胞包括间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)、脂肪干细胞(Adipose
‑
derived stem cells,ADSCs,或Adipose stem cells,ASCs)、肌腱和/或韧带来源细胞和软骨细胞(chondrocytes)等。而体内天然存在的可用于细胞治疗的细胞数量少，无法满足细胞治疗需求，因此，体外扩增质量与数量均佳的干细胞是目前干细胞疗法实施的保障。
[0004]体内细胞生长的天然微环境十分复杂，除血管壁细胞和血液相关细胞，体内其它细胞都处于没有血清的细胞外液中，成分复杂的细胞外液、细胞与细胞的相互作用、细胞与胞外基质的相互作用构成了体内细胞生长的复杂天然微环境。不同组织/器官来源的细胞在体内所处的微环境不同，如细胞外液成分种类、含量不同，细胞与细胞、细胞与胞外基质间相互作用不同，这些微环境与组织/器官的功能相匹配，能够良好促进体内细胞的增殖、表型维持、代谢等生命活动，以维持组织/器官功能。目前我们对体内复杂且多样的微环境具体成分和相互作用机制知之甚少，只是探索了它的冰山一角，无法从中得到很好的启发在体外模拟体内微环境进行细胞培养。而目前体外干细胞的培养环境以含有血清的培养基为主，常用的血清可以是胎牛血清，但是体内细胞所在的细胞外液微环境是没有血清的，并且由于成分复杂的细胞外液、细胞与细胞的相互作用、细胞与胞外基质的相互作用导致体内细胞的生长环境特别复杂，使得体内和体外两种环境的差别非常大，体外干细胞的培养环境无法维持培养细胞的增殖和表型，因此如何在体外更好地模拟体内细胞生长环境是目前体外细胞培养尚未解决的一大难题。
[0005]以肌腱和/或韧带来源细胞的体外培养为例：
[0006]肌腱和/或韧带来源的细胞是从肌腱或韧带组织中分离提取出来的一类混合的细
胞，是高表达多个肌腱/韧带组织特异性的基因和蛋白质scleraxis(SCX)、nestin(NES)、tenomodulin(TNMD)、thrombospondin
‑
4(THBS4)、collagen type I alpha 1(COL1,COL1A1)、腱生蛋白
‑
C(Tenascin
‑
C)等的一类细胞，它包含肌腱干/祖细胞(Tendon stem/progenitor cells,TSPCs，tendon derived stem cells,TDSCs,tendon stem cells,TSCs)、肌腱细胞(Tenocyte)、成腱细胞(tenoblasts)、成纤维细胞(fibroblast)、韧带干/祖细胞、韧带细胞等，是最为理想的用于肌腱损伤治疗的种子细胞。国内外本领域研究者相继从小鼠、人、大鼠、兔子肌腱中分离出肌腱干细胞并对功能和表型做了多能性等全面的鉴定。研究表明这类细胞不仅具有像骨髓间充质干细胞一样的干细胞特性，而且高表达多个scleraxis(SCX)、nestin(NES)、tenomodulin(TNMD)、thrombospondin
‑
4(THBS4)、collagen type I alpha 1(COL1,COL1A1)、腱生蛋白
‑
C(Tenascin
‑
C)等肌腱组织特异性的基因和蛋白质。因此，肌腱和/或韧带来源的细胞，尤其是肌腱干细胞被认为是肌腱组织工程与肌腱损伤细胞治疗的适合种子细胞。
[0007]由于成熟肌腱和/或韧带组织中存在的细胞数目少，提取出来的肌腱和/或韧带来源细胞数量不足以应用于肌腱损伤再生，在体外培养环境下将其扩增，以得到数量和质量均佳的肌腱和/或韧带来源的细胞是十分必要的。因此，为了满足肌腱和/或韧带损伤临床治疗的目的，体外培养的肌腱和/或韧带来源的细胞必须同时满足一定的质量与数量要求，肌腱和/或韧带来源细胞既具有间充质干细胞、脂肪干细胞等细胞的干细胞共有特征，也具有其独特的肌腱表型，以上所述的质量与数量要求主要从干细胞共有特征和肌腱/韧带来源细胞特有表型两个大的方面进行评估打分，总评分为100分。具体评分标准如下(Bi Y et al.,Nature medicine,2007,13(10):1219
‑
27.Harvey T,Nature cell biology,2019,21(12):1490
‑
1503.Yin Z et al.,Science advances,2016,2(11):e1600874.Lee SY,Stem Cells,2015,33(10):2995
‑
3005.Zhang C,Biomaterials,2018,172:66
‑
82.)：
[0008]一、干细胞共有特征(也称细胞共有特征)(60分)
[0009]1.增殖速度(30分)：细胞倍增时间在30h(小时)及以内为30分，细胞倍增时间在76h以内或者一周增殖5倍以上为及格线10分，细胞倍增时间在76h
‑
100h为5分，细胞倍增时间在100h以上为0分。
[0010]2.干细胞表型(20分)：干细胞表型包括干细胞表面标志、克隆形成能力及三系分化能力。干细胞表面标志包括阳性标志物CD105,CD90,CD44，其表达需在95％以上为表型维持或提高，阴性标志物CD34、CD18，其表达需在1％或以下为表型维持；克隆形成能力是指细胞的单克隆形成能力，克隆形成能力优于现有血清培养技术培养的细胞为提高，克隆形成能力与现有血清培养技术培养的细胞一致为维持。三系分化能力包括成骨分化能力、成软骨分化能力和成脂分化能力，三系分化能力优于现有血清培养技术培养的细胞为提高，三系分化能力与现有血清培养技术培养的细胞一致为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生物活性物质组合物，其特征在于：所述生物活性物质组合物包含成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子
‑
β、糖皮质激素、肝素或其盐、维生素C或其衍生物、转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺或其盐、亚硒酸盐，其中，各组分质量
‑
体积浓度范围比例为：成纤维细胞生长因子∶血小板衍生生长因子∶转化生长因子
‑
β∶糖皮质激素∶肝素或其盐∶维生素C或其衍生物∶转铁蛋白∶胰岛素∶黄体酮∶腐胺或其盐∶亚硒酸盐＝1
‑
50∶1
‑
50∶1
‑
40∶1
‑
11∶10
‑
5000∶10
‑
100000∶10
‑
300000∶1
‑
25000∶1
‑
25∶1
‑
25000∶1
‑
25；优选地，所述成纤维细胞生长因子∶血小板衍生生长因子∶转化生长因子
‑
β∶糖皮质激素∶肝素或其盐∶维生素C或其衍生物∶转铁蛋白∶胰岛素∶黄体酮∶腐胺或其盐∶亚硒酸盐＝5
‑
40∶5
‑
40∶2
‑
30∶1
‑
8∶500
‑
4000∶1000
‑
90000∶1000
‑
200000∶10
‑
15000∶1
‑
15∶2
‑
15000∶1
‑
15；更优选地，成纤维细胞生长因子∶血小板衍生生长因子∶转化生长因子
‑
β∶糖皮质激素∶肝素或其盐∶维生素C或其衍生物∶转铁蛋白∶胰岛素∶黄体酮∶腐胺或其盐∶亚硒酸盐＝10
‑
30∶10
‑
30∶3
‑
20∶2
‑
5∶1000
‑
2000∶10000
‑
80000∶2000
‑
80000∶100
‑
5000∶2
‑
7∶7
‑
10000∶2
‑
7；优选地，所述转铁蛋白在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为0.1
‑
300μg/ml,占质量比为0.00001％
‑
0.03％；优选地，所述转铁蛋白在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
200μg/ml,占质量比为0.0001％
‑
0.02％；优选地，所述转铁蛋白在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
150μg/ml,占质量比为0.0001％
‑
0.015％；优选地，所述胰岛素在所述生物活性物质组合物中质量
‑
体积浓度为0.01
‑
50μg/ml，占质量比为0.000001％
‑
0.005％；优选地，所述胰岛素在所述生物活性物质组合物中质量
‑
体积浓度为0.1
‑
30μg/ml，占质量比为0.00001％
‑
0.003％；优选地，所述胰岛素在所述生物活性物质组合物中质量
‑
体积浓度为1
‑
20μg/ml，占质量比为0.0001％
‑
0.002％；优选地，所述黄体酮在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为0.1
‑
50ng/ml,占质量比为0.00000001％
‑
0.000005％；优选地，所述黄体酮在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
30ng/ml,占质量比为0.0000001％
‑
0.000003％；优选地，所述黄体酮在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为2
‑
20ng/ml,占质量比为0.0000002％
‑
0.000002％。2.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子选自FGF
‑
basic，FGF1，FGF2，FGF4，FGF7，FGF10，FGF18，成纤维生长因子合成肽任意一种或多种；优选地，所述成纤维细胞生长因子在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
100ng/ml，占质量比为0.0000001％
‑
0.00001％；优选地，所述成纤维细胞生长因子在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为5
‑
70ng/ml，占质量比为0.0000005％
‑
0.000007％；优选地，所述成纤维细胞生长因子在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为10
‑
40ng/ml，占质量比为0.000001％
‑
0.000004％。3.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述血小板衍生生长因子选自PDGF
‑
AA，PDGF
‑
AB，PDGF
‑
BB，血小板衍生生长因子合成肽任意一种或多种；优选地，所述血小板衍生因子在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
100ng/ml，占质量比0.0000001％
‑
0.00001％；优选地，所述血小板衍生因子在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为5
‑
70ng/ml，占质量比为0.0000005％
‑
0.000007％；优选地，所述血小板衍
生因子在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为10
‑
40ng/ml，占质量比为0.000001％
‑
0.000004％。4.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述转化生长因子
‑
β选自TGF
‑
β1，TGF
‑
β2，TGF
‑
β3，转化生长因子
‑
β合成肽任意一种或多种；优选地，所述转化生长因子
‑
β在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为0.1
‑
80ng/ml，占质量比为0.00000001％
‑
0.000008％；优选地，所述转化生长因子
‑
β在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为2
‑
50ng/ml，占质量比为0.0000002％
‑
0.000005％；优选地，所述转化生长因子
‑
β在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为5
‑
25ng/ml，占质量比为0.0000005％
‑
0.0000025％。5.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述糖皮质激素选自地塞米松或其盐、地塞米松溶剂化物、氢化可的松或其盐、氢化可的松溶剂化物、醋酸可的松、可的松或其盐、甲氢泼尼松琥珀酸钠、泼尼松、倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸倍氯米松、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙的任意一种或多种；优选地，所述糖皮质激素在所述生物活性物质组合物中的摩尔浓度为0.1
‑
90nM，占质量比为0.0000000039％
‑
0.00000354％；优选地，所述糖皮质激素在所述生物活性物质组合物中的摩尔浓度为1
‑
50nM，占质量比为0.000000039％
‑
0.00000197％；优选地，所述糖皮质激素在所述生物活性物质组合物中的摩尔浓度为1
‑
20nM，占质量比为0.000000039％
‑
0.000000785％。6.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述肝素或其盐选自肝素，肝素钠，肝素钙的任意一种或多种；优选地，所述肝素或其盐在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为0.1
‑
10μg/ml，占质量比为0.00001％
‑
0.001％；优选地，所述肝素或其盐在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为0.5
‑
8μg/ml，占质量比为0.00005％
‑
0.0008％；优选地，所述肝素或其盐在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
5μg/ml，占质量比为0.0001％
‑
0.0005％。7.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述维生素C或其衍生物选自维生素C(即抗坏血酸)、抗坏血酸葡糖苷、乙基维生素C、3
‑
o
‑
乙基抗坏血酸、维生素C磷酸镁、维生素C磷酸钠、L
‑
抗坏血酸2
‑
磷酸倍半镁盐水合物、维生素C四异棕榈酸盐、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸2磷酸6棕榈酸酯、酯化型维他命C、抗坏血酸的其它溶剂化物的任意一种或多种；优选地，所述维生素C或其衍生物在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度0.1
‑
100μg/ml，占质量比为0.00001％
‑
0.01％；优选地，所述维生素C或其衍生物在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度1
‑
100μg/ml，占质量比为0.0001％
‑
0.01％；优选地，所述维生素C或其衍生物在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度10
‑
80μg/ml，占质量比为0.001％
‑
0.008％。8.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述腐胺或其盐选自腐胺、腐胺二盐酸盐的任意一种或多种；优选地，所述腐胺或其盐在所述生物活性物质组合物中质量
‑
体积浓度为0.01
‑
50μg/ml，占质量比为0.000001％
‑
0.005％；优选地，所述腐胺或其盐在所述生物活性物质组合物中质量
‑
体积浓度为0.1
‑
40μg/ml，占质量比为0.00001％
‑
0.004％；优选地，所述腐胺或其盐在所述生物活性物质组合物中质量
‑
体积浓度为1
‑
30μg/ml，占质量比为0.0001％
‑
0.003％。9.根据权利要求1所述的生物活性物质组合物，其特征在于：所述亚硒酸盐为可溶于水
的亚硒酸盐；优选地，所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠；优选地，所述亚硒酸盐在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为0.1
‑
50ng/ml,占质量比为0.00000001％
‑
0.000005％；优选地，所述亚硒酸盐在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为1
‑
30ng/ml,占质量比为0.0000001％
‑
0.000003％；优选地，所述亚硒酸盐在所述生物活性物质组合物中的质量
‑
体积浓度为2
‑
20ng/ml,占质量比为0.0000002％
‑
0.000002％。10.一种生物活性物质组合物的制备方法，其特征在于：所述生物活性物质组合物的制备包含将成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子
‑
β、糖皮质激素、肝素或其盐、维生素C或其衍生物、转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺或其盐、亚硒酸盐按比例进行混合的步骤，各组分的添加顺序不分先后，各组分质量
‑
体积浓度范围比例为：成纤维细胞生长因子∶血小板衍生生长因子∶转化生长因子
‑
β∶糖皮质激素∶肝素或其盐∶维生素C或其衍生物∶转铁蛋白∶胰岛素∶黄体酮∶腐胺或其盐∶亚硒酸盐＝1
‑
50∶1
‑
50∶1
‑
40∶1
‑
11∶10
‑
5000∶10
‑
100000∶10
‑
300000∶1
‑
25000∶1
‑
25∶1
‑
25000∶1
‑
25；优选地，所述成纤维细胞生长因子∶血小板衍生生长因子∶转化生长因子
‑
β∶糖皮质激素∶肝素或其盐∶维生素C或其衍生物∶转铁蛋白∶胰岛素∶黄体酮∶腐胺或其盐∶亚硒酸盐＝5
‑
40∶5
‑
40∶2
‑
30∶1
‑
8∶500
‑
4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓，张鸿，欧阳宏伟，茵梓，沈炜亮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：