基于气味结合蛋白的电化学传感器及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了基于气味结合蛋白的电化学传感器及其构建方法和应用。具体包括以下步骤1）对多孔纳米氧化铝孔道处理；2）在纳米氧化铝孔道上修饰人气味结合蛋白；3）基于电化学方法利用所制备的传感器检测不同的目标气味分子；4）利用所制备的电化学传感器应用于实际样品的检测。本发明专利技术不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，利用纳米孔的纳米级别优势和人气味结合蛋白的结合能力，对目标气味分子的检测可达更低的检测下限，具有对气味物质的灵敏检测，快速检测等优点。快速检测等优点。快速检测等优点。

【技术实现步骤摘要】
基于气味结合蛋白的电化学传感器及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物传感器领域，具体涉及基于气味结合蛋白的电化学传感器及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]生活中，各事各物都具有气味，例如香味，臭味，异味等各种类型。人类能够检测并区分上亿种不同的气味刺激，其中人气味结合蛋白发挥了非常重要的作用。人气味结合蛋白是一种低分子量的可溶性蛋白质，它主要存在于人嗅觉神经细胞外侧的淋巴液中，是一种运载蛋白，其作用是与目标气味分子可逆地结合，并运输此类疏水性小分子至嗅觉细胞上的嗅觉受体，进而促使产生嗅觉。人们往往通过对气味进行感知然后做出相应的判断。
[0003]由于人对气味刺激的感知能力是有限的，对于微弱的气味，可能会感知不到或感知的较慢，因此借助一些方式方法对环境中的气味进行灵敏检测，对人们的生活生产具有至关重要的作用。目前，基于气味结合蛋白的传感器已经受到了人们的重视，现已开展有利用石英晶体微天平，表面等离子体共振，电化学阻抗等传感器的方法，但现有方法的检测下限，灵敏度等仍不能满足要求。
[0004]因此，利用纳米孔的纳米级别的优势和人气味结合蛋白结合气味分子，借助纳米孔的纳米级优势可以克服电化学检测方法对低浓度目标检测物不响应的缺陷，提高检测灵敏度。由此，发展一种基于气味结合蛋白检测水果香味物质的电化学传感器构建的分析方法，以期实现高灵敏的检测气味物质。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了基于气味结合蛋白检测水果香味物质的电化学传感器及其构建方法和应用。本专利技术不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，利用纳米孔的纳米级别优势和人气味结合蛋白结合气味分子的作用，对目标气味分子的检测可达更低的检测下限，可实现对气味物质的灵敏检测。
[0006]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了基于气味结合蛋白的电化学传感器的构建方法，包括以下步骤：
[0007]1)将预处理后的多孔纳米氧化铝孔道浸泡在三(2
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羧乙基)膦盐酸盐水溶液中，常温避光48～72小时进行修饰改性得到纳米孔阵列；
[0008]2)用足量的超纯水冲洗后氮气吹干，使用等体积的EDC/NHS溶液活化所修饰的纳米孔阵列10～20分钟，活化后用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，使pH处于7～8之间；
[0009]3)向已活化好的纳米孔道中加入人气味结合蛋白溶液，最后，将板孔中的溶液通过振荡器混合2～5分钟，并将它们放在4～10℃下孵育2小时；
[0010]4)达孵育处理时间后用0.1M PBS缓冲液冲洗以除去未反应的EDC/NHS溶液和未结合的蛋白质，得到基于气味结合蛋白的电化学传感器。
[0011]其中，所述三(2
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羧乙基)膦盐酸盐水溶液的浓度为5mM～6mM，所述三(2
‑
羧乙基)
膦盐酸盐水溶液用量为100～300μL，所述EDC/NHS溶液为EDC溶液和NHS溶液的混合溶液，所述EDC溶液的浓度为6mg/ml～8mg/ml，由EDC溶解在0.1M MES缓冲液制得，所述溶液用量为50～100μL，所述NHS溶液的浓度为12mg/ml～16mg/ml，由NHS溶解在0.1M PBS缓冲液制得，所述溶液用量为50～100μL，所述MES缓冲溶液为：0.1M MES、0.5M NaCl，pH＝5～6，所述0.1M PBS缓冲溶液为：137mM NaCl、10mM NaH2PO4、2.7mM KCl、2mM KH2PO4，pH＝7～8。
[0012]其中，所述人气味蛋白溶液浓度为10μg/mL～30μg/mL。
[0013]本
技术实现思路
还包括所述的构建方法得到的基于气味结合蛋白的电化学传感器，所述电化学传感器是将人气味结合蛋白修饰在纳米氧化铝孔道上获得，所述多孔纳米氧化铝孔道孔径为40
‑
70nm，所述人气味结合蛋白为hOBP 2B。
[0014]本
技术实现思路
还包括所述的基于气味结合蛋白的电化学传感器在检测香味物质中的应用。
[0015]其中，所述应用具体包括：将待检测目标分子溶解于一定体积分数甲醇溶液中，配制得一系列浓度的目标分子溶液，将所制备得到的电化学传感器利用自制的三电极体系采用电化学方法检测目标分子，得到相应的浓度梯度变化曲线，每一个浓度的目标分子测量后，将测试的目标分子溶液从纳米氧化铝孔道中取出，用电化学工作站电流
‑
时间方法检测每一目标物质的电流随时间的变化曲线，根据电流信号不同可以得出同一目标物质的不同浓度对应电流信号不同，从而通过变化曲线上的电流信号反映目标物质的浓度。检测结束后加入400μL 0.1M PBS缓冲溶液来浸泡纳米孔阵列10分钟以消除残留的配体复原人气味结合蛋白。每一浓度的目标分子平行操作检测3次，减少误差影响。
[0016]其中，所述待检测目标分子为香草醛、月桂酸和乙酸乙酯，所述目标分子浓度为0.1pg/mL～5pg/mL；所述甲醇溶液的浓度为体积分数为1％～10％甲醇水溶液，所述自制的三电极体系为铂电极作对电极，银
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氯化银电极作参比电极，氧化铝孔道，铂片和铜电极一起作为工作电极，所述电化学检测所用电解液为10mM K3[Fe(CN)6]和0.1M KCl等体积的混合溶液。
[0017]其中，所述目标分子浓度具体优选为0.1pg/mL，0.5pg/mL，1pg/mL，5pg/mL。
[0018]其中，将制备的电化学传感器同实际样品放置在密闭的容器里一段时间，检测操作同标准气味物质溶液的检测一致，利用电化学检测的电流信号来反映相应气味物质的含量。
[0019]其中，所述实际样品为香蕉时，其中气味中含量最多的是乙酸乙酯，通过该传感器检测从青色生香蕉到黄色熟香蕉过程中的乙酸乙酯含量。
[0020]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具备以下优点：本专利技术原理简单、所用方法简单、实验周期短，无需任何大型仪器，实验成本低，检测相对灵敏，在相同条件下可以更方便快捷的检测出目标物质。本专利技术借助于多孔纳米氧化铝孔道的纳米级优势，在孔道上修饰人气味结合蛋白，基于人气味结合蛋白与气味分子的结合，采用电化学方法检测目标气味分子，根据电化学方法所检测得到的电信号变化，反映出目标气味分子的检测效果。利用电化学方法检测的电信号响应，可实现更低浓度目标气味分子的检测，相比其他电化学方法，检测浓度低两个数量级，灵敏度更高；此外，在本浓度范围内，电化学阻抗方法无法产生灵敏响应，不适用于检测该目标物。本专利技术不需要借助昂贵精密仪器检测，检测方法简单易进行，极大地降低了气味分子的检测成本，具有灵敏度高、检测时间短等优点。
附图说明
[0021]图1显示了基于气味结合蛋白检测水果香味物质的电化学传感器构建的分析方法的流程图，图1A表示人气味结合蛋白生物传感器的构建过程图，图1B表示基于电化学方法人气味结合蛋白生物传感器检测目标分子的过程图；
[0022]图2A显示了基于电化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于气味结合蛋白的电化学传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将预处理后的多孔纳米氧化铝孔道浸泡在三（2
‑
羧乙基）膦盐酸盐水溶液中，常温避光48～72小时进行修饰改性得到纳米孔阵列；2）用足量的超纯水冲洗后氮气吹干，使用等体积的EDC/NHS溶液活化所修饰的纳米孔阵列10～20分钟，活化后用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，使pH=7~8；3）向已活化好的多孔纳米氧化铝孔道中加入人气味结合蛋白溶液，最后，将板孔中的溶液通过振荡器振荡混合2～5分钟，并将它们放在低温4～10℃下孵育2~3小时；4）达孵育处理时间后用PBS缓冲液冲洗以除去未反应的EDC/NHS溶液和未结合的蛋白质，得到基于气味结合蛋白的电化学传感器。2.根据权利要求1所述的基于气味结合蛋白的电化学传感器的构建方法，其特征在于，所述三（2
‑
羧乙基）膦盐酸盐水溶液的浓度为5mM～6mM，所述EDC/NHS溶液为EDC溶液和NHS溶液的混合溶液，所述EDC溶液的浓度为6mg/mL～8mg/mL，由EDC溶解在MES缓冲液制得，EDC溶液用量为50～100μL；所述NHS溶液的浓度为12mg/mL～16mg/mL，由NHS溶解在PBS缓冲液制得，NHS溶液用量为50～100μL；所述MES缓冲溶液为：MES、NaCl，pH=5～6，所述PBS缓冲溶液pH=7～8。3.根据权利要求1所述的基于气味结合蛋白的电化学传感器的构建方法，其特征在于，所述人气味蛋白溶液浓度为10μg/mL～30μg/mL。4.权利要求1
‑
3任一项所述的构建方法构建得到的基于气味结合蛋白的电化学传感器，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫伟，唐艳华，刘松琴，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：