一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型技术

本发明专利技术公开了一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型，该方法包括如下步骤：S1：采集污染场地土壤样品；S2：制备生物暴露样品；S3：构建动物模型、血液采样；S4：制备待检测全血样品；S5：样品前处理、测定其中苯并[a]芘的浓度含量；S6：计算相对生物有效性；S7：计算实际暴露量数据；S8：进行环境健康风险评价。本发明专利技术还公开了实施该方法的动物模型，其是基于啮齿类实验动物内暴露的标准化动物模型。本发明专利技术通过合理的设计实验与检测步骤，配合标准化的可定量检测的动物模型，精确测定污染场地土壤样品中苯并[a]芘的相对生物有效性，应用于受污染土壤修复治理，在保障人群健康的前提下，降低治理成本。降低治理成本。降低治理成本。

【技术实现步骤摘要】
一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型


[0001]本专利技术涉及场地土壤有机污染物检测及环境健康风险治理
，具体涉及一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型。

技术介绍

[0002]苯并[a]芘（Benzoapyrene，BaP）是多环芳烃类挥发物中的一种，具体是一种五环多环芳香烃，化学式为C
20
H
12
，英文表示为BaP。苯并[a]芘存在于煤焦油中，而煤焦油可见于汽车废气（尤其是柴油引擎）、烟草与木材燃烧产生的烟，以及炭烤食物等污染源中。苯并[a]芘为一种突变原和致癌物质，从18世纪以来，便发现其与许多癌症有关。其在体内的代谢物二羟环氧苯并芘，是具有致癌性的物质。由污染源扩散的苯并[a]芘广泛存在于大气、水和土壤等各类环境介质中，其中土壤介质是这类化学物质的最终归宿，特别是污染场地土壤中含有较高浓度水平的苯并[a]芘，如炼焦行业、石油加工业和煤化工产业等场地中该物质污染非常普遍。
[0003]苯并[a]芘属于国际癌症组织（IRIS）分类中的Ⅰ类致癌物，即对人类明确的致癌物，另外，苯并[a]芘还具有神经毒性，其经由环境介质通过吸入、摄食和皮肤接触进入人体，严重威胁人类健康。针对污染场地土壤中的苯并[a]芘，现有技术中，一般是采用环境健康风险评价来评估其健康危害，为场地的污染修复奠定基础。
[0004]生物有效性是用来表示污染物被生物吸收以后在其生物体内的利用率以及对自身潜在的危害。研究自然环境中有害污染物的生物有效性对污染现状的生物修复、污染物对生物体的生态毒理以及对环境污染现状的风险评估的研究都具有重要的意义。
[0005]现有技术中，中国专利技术专利申请CN201911088924.0公开了基于光谱分析预测土壤中高环PAHs生物有效性的建模方法，属于多环芳烃的生物有效性预测技术，包括以下步骤：（1）土壤样品收集和前处理，（2）用化学氧化法氧化土壤样品，（3）将原土样以及其对应氧化后的土样进行红外光谱测定，得到各波长红外吸光度占比，（4）建立16种PAHs的浓度与各红外占比的拟合曲线，比较不同环数多环芳烃与不同波长吸光度占比的回归模型，（5）对回归模型进行筛选，获得相关度最佳的回归模型，得到该场地高环多环芳烃与吸光度占比的函数关系；该专利技术建立了相对精确快速，基于PAHs有效态预测污染土壤中PAHs的生物有效性的光谱模型，便于后续对PAHs的生物有效性及其所带来的环境健康风险进行研究。但是，该专利技术技术方案是通过PAHs不同效态而预测生物有效性，其相对生物法存在一定偏差，数据可信度较低。目前我国进行污染场地健康风险评价时，均认为土壤中的污染物可100%被人体吸收，即生物有效性为100%，并在此基础上进行风险评价和确定修复目标。然而，实际上土壤中污染物进入人体后其生物利用程度小于等于100%，因此当前的场地风险评价会高估污染物的健康风险并导致过度修复，容易造成修复成本高昂和资源浪费。但是，目前尚无准确的生物有效性检测方式及基于生物有效性的土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法及动物模型，尤其缺少大范围、低成本、精确度高的风险测评方法及动物模型。
[0006]目前，污染物进入生物体利用程度可用体外研究和体内研究的方法进行测定，一
般体外研究获得生物利用程度称为生物可利用性（也称为生物可给性），通过体内研究获得的为生物有效性。生物有效性分两类（bioavailability）：其一是指绝对生物有效性（absolute bioavailability，AB），即为物质口服摄入后到达体循环的百分比，通常使用生物口服摄入剂量与静脉注射剂量的血浆浓度
‑
时间曲线下面积（AUC）比计算得到；另一个是指相对生物有效性（relative bioavailability，RB），即为相同暴露途径给予生物不同介质载体下的化学物质进入生物体的百分比，通常使用生物经口摄入土壤与含相同浓度化学物质的标准材料的血浆浓度
‑
时间曲线下面积（AUC）比计算得到。目前在风险评估研究中常应用相对生物有效性。
[0007]现有技术中，一般通过体外研究获得生物可给性的操作较为简便，只通过模拟实验即可实现，但是结果相对偏差较大；通过体内研究获得生物有效性相对更准确，但是需要通过动物实验实现，对技术操作和场地要求较高，而且缺乏标准化的可定量检测的试验模型。例如中国专利技术专利201910387560.X公开的一种测定锑相对生物有效性的小鼠模型建立方法，通过连续暴露含锑物质后测定靶器官中的锑计算相对生物有效性，该专利技术专利测定各种器官确定靶器官的方式，不适用其他物质，同时大量的组织样品采集和测定显著提高了实验人员的技术要求和测定成本，较难标准化推广；中国专利技术专利201911245086.3公开的一种测定土壤和食品中镍的小鼠生物有效性方法，通过测定尿中镍含量来推算出镍的小鼠相对生物有效性，该专利技术专利通过测定尿中排出污染物含量的方式来推算被生物体吸收后生物有效性，推算过程不能精确反应实际被生物体吸收的量，另外该方法更适宜用在检测较容易的无机物上，对于代谢和检测更复杂的有机物降低了适用性。
[0008]由于目前关于有机物的体内定量化的测定研究较少，且由于在体内研究中不同类型污染场地土壤的性质和污染物的性质对生物有效性有较大影响，因此往往需要持续开展包括多种场地类型的多种场地土壤的生物有效性研究，需要进行的实验室检测数量较多，但是现有的检测方式并不支持大通量、大范围土壤的试验和检测，导致耗时较长、检测材料消耗较多。
[0009]此外，传统的动物模型实验，由于需要保证检测准确性，一般需要采集5~10mL血液进行采集；对于大鼠等小型实验动物而言，一般采用染毒后短时间内在腹主动脉取血、一次可得到约10mL血液，取血后大鼠即死亡，无法将其用于后续的较长时间的代谢毒性水平试验，以及重复染毒的代谢试验。而如果要保持大鼠等实验动物存活、进行长时间的试验，则单次采样取血量不能超过1mL血液。现有的检测技术，尚无法通过对1mL血液的小容量样品，进行准确的检测，因此都是采取一次取样10mL血液、然后处死大鼠，导致动物试验需要消耗大量的实验动物，因此只能采用较少的实验动物进行检测、难以解决个体实验数据差异大的问题；同时，采用同一批实验动物不能进行多次采血，以实现对较多地点采集的不同土壤样品进行检测，导致检测成本高。

技术实现思路

[0010]为克服现有技术所存在的上述不足之处，本专利技术的目的在于，提供一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，提出了新的以经口暴露血样中苯并[a]芘作为标志物计算相对生物有效性，再根据实际暴露量数据进行环境健康风险评价的技术构思，具体通过合理的设计实验与检测步骤、配合标准化的可定量检测的动物模型，进行精准的测定污染场
地土壤样品中苯并[a]芘的相对生物有效性、进行环境健康风险评价，达到减少单次血样容量、降低检测耗材总消耗量、缩短评价周期、提高测评准确性；同时，提供一种动物模型，使同一批实验动物能够对不同地点采集的土壤样品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1：采集污染场地含苯并[a]芘的土壤样品；S2：将土壤样品制备为实验动物的生物暴露样品；S3：构建基于啮齿类实验动物暴露的标准化动物模型，以苯并[a]芘为标志物，根据设定的生物暴露方式和剂量，将生物暴露样品灌胃给实验动物，在染毒后达到预定的体内代谢时间点后，分别对实验动物进行血液采样；S4：将在设定的多个代谢时点采集的实验动物血样，分别制备为待检测全血样品；S5：对各全血样品进行前处理，然后，采用气相色谱/质谱联用仪测定其中苯并[a]芘的浓度含量；S6：计算出各个代谢时点、基于实验动物的苯并[a]芘相对生物有效性；S7：计算出基于动物试验的苯并[a]芘相对生物有效性的场地土壤污染物经口暴露的实际暴露量数据；S8：基于实际暴露量数据，进行环境健康风险评价。2.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S1，污染场地土壤样品的采集和处理，具体包括如下步骤：选取土壤中含苯并[a]芘的场地，在该场地污染核心区用土钻采集地表至10cm深的土壤样品不少于5份，混合装袋，带回实验室自然风干后，用手工研磨，过300目筛，使得其粒径小于50μm，制得土样。3.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S2，制备生物暴露样品，具体包括如下步骤：初步检测场地土壤中苯并[a]芘浓度值，根据实验动物体重，给予设定比例苯并[a]芘的暴露剂量；按照实验动物体重准备土样，并用植物油为溶剂制备苯并[a]芘土样悬浊液待用；另使用苯并[a]芘标准品，配置出相同剂量的苯并[a]芘标准品油溶灌胃制剂。4.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S3，具体包括如下步骤：选取啮齿类实验动物构建基于暴露的标准化动物模型，准备符合实验条件的多只实验动物作为实验组，根据设定的暴露剂量，将生物暴露样品苯并[a]芘土样悬浊液经灌胃给予每只实验动物，在样品达到预定的体内代谢时间点0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时后，分别于各时间点随机选取部分实验动物，进行血液采样，各时间点采样所选取的实验动物不重复；另外选取与实验组等量的实验动物作为对照组，经灌胃给予每只实验动物相同剂量的苯并[a]芘标准品油溶制剂，灌胃之后分别于0.25、0.5、1、2、4、6、12、24小时的时间点，分别随机选取部分实验动物，进行血液采样，各时间点采样所选取的实验动物不重复。5.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S4，采集血样并制备为待检测样品，具体包括如下步骤：将两组实验动物经口暴露到设定的时间点后，分别采集血样，所有血样样品采集使用添加抗凝剂的采血管，单次单体采集容量1mL的新鲜血液后充分摇匀，静置后，于低温离心机离心取上层液置于棕色玻璃瓶中，旋紧内置聚四氟乙烯垫的瓶盖；然后将所有瓶装样品在
‑
20℃温度下冰冻保存待用。
6.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S5，样品前处理及检测，具体包括如下步骤：样品前处理：将各瓶装血样取出后置冰排上融化，充分混匀后，取0.5mL血浆，按体积比1:3比例加入1.5mL正己烷，充分振摇后，冰浴下超声提取40min，离心机上4500rpm离心10min，分离上清液至新试管中，再向血浆中加入1.5mL正己烷，重复上述操作，将上清液取出，与第一次提取液合并；氮吹至100μL，取90μL上清液，加入10μL 0.05μg/mL内标物，使内标物浓度和校准溶液一致，按制作校准曲线的仪器条件测定样品；检测：采用气相色谱/质谱联用仪测定各瓶装样品中的苯并[a]芘浓度，色谱载气为1.5mL/min氦气，恒流不分流进样口，无填充玻璃棉衬管，进样体积1.0
µ
L，进样口温度200℃，柱箱程序升温；质谱接口温度300℃，EI离子源温度240℃，四级杆温度180℃，离子化电压70eV，溶剂延迟3min，质谱参数设为选择离子扫描收集数据，分别获得实验组及对照组瓶装样品中的苯并[a]芘浓度数据。7.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S6，实验动物相对生物有效性的计算，具体包括如下步骤：将步骤S5获得的实验组及对照组数据代入下列公式中，计算得到相对生物有效性RB：（1）其中：AUC
soil
是实验组、油溶污染土壤暴露后血浆中苯并[a]芘浓度—时间曲线下面积；AUC
oil
是对照组、油溶标准品暴露后大鼠血浆中苯并[a]芘浓度—时间曲线下面积；D
soil
是实验组给予实验动物的苯并[a]芘剂量；D
oil
是对照组给予实验动物的苯并[a]芘剂量；AUC数值由数据经非房室模型拟合后获取。8.根据权利要求7所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S7，基于相对人体生物有效性的场地土壤污染经口暴露的实际暴露量数据的计算，具体包括如下步骤：将步骤S6所得数据代入公式（2），计算基于苯并[a]芘相对生物有效性的场地土壤污染经口暴露的实际日均暴露量：E=(C_site
×
RB
×
IR
×
EF
×
ED)/(BW
×
AT)
ꢀꢀ
（2）其中：E是人体经口摄入的场地土壤中污染物的日均暴露剂量（致癌效应），mg/(kg
·
d)；C_site是场地土壤中污染物的浓度，mg/kg，采用场地污染物实测值；RB为场地土壤中污染物的相对生物有效性，无量纲，采用动物模型实测值；IR是人体摄入速率，kg/d，取值1
×
10
‑
4 kg/d；EF是人体暴露频率，d/a，取值350d/a；ED是人体持续暴露时间，a，取值24a；BW是人体体重，kg，取值56.8kg；AT是人体平均暴露时间，d，取值70
×
365 d。9.根据权利要求1所述土壤中苯并[a]芘环境健康风险测评方法，其特征在于，所述的步骤S8，基于实...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏天翔，王琼，李慧颖，董小艳，贾晓洋，崔倩，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，
类型：发明
国别省市：