一种检测生物体内Fe制造技术

本发明专利技术涉及一种基于嘧啶基染料，可通过光调控快速、灵敏检测生物体内Fe

【技术实现步骤摘要】
一种检测生物体内Fe
2+
的双光子荧光探针及其制备方法和的应用


[0001]本专利技术涉及一种基于嘧啶基染料，可通过光调控快速、灵敏检测生物体内Fe
2+
的双光子荧光探针，属于有机荧光探针领域。

技术介绍

[0002]铁是生物圈中普遍分布的过渡金属，由于其参与电子转移反应的能力，对维持正常细胞功能必不可少，然而过量的铁，尤其是具有氧化还原活性的Fe
2+
，也可能生成有毒的活性氧(ROS)，进而损害机体。研究表明，铁代谢异常引起的氧化应激与帕金森病(Parkinson
’
s disease,PD)等一些疾病密切相关。基于铁在这些疾病中所处的重要地位，快速、准确的检测细胞内Fe
2+
水平，对于研究PD等疾病的发病机制以及有效监控疾病的发生、发展有重要意义。
[0003]因此，开发实时、无创的Fe
2+
特异性检测工具对于研究PD等相关疾病的发病机制尤为重要。为了解决这一问题，研发可以高效、精准检测Fe
2+
的荧光探针将具有重大价值。
[0004]商业化的Fe
2+
荧光探针直到近几年才出现，主要有两种：FeRhoNox
‑
1和FerroOrange。根据相关报道，这些探针已经可以实现Fe
2+
的体内外检测，但是价格昂贵(1300元/50μg或2480元/24μg)，并且由于单光子激发的特性，这些探针在生物组织中的穿透深度将受到限制，这也会影响探针在生物体内的成像效果。同时，这些探针的检出限和疾病应用模型等数据尚不明确。
[0005]在此，我们提出了一种双光子荧光探针PyFe(可由单光子488nm或双光子880nm激发，630nm发射)，它除了对Fe
2+
具有极高选择性和快速的响应速率外，还具有极低的理论检出限(0.04nM)，并可以实现低浓度Fe
2+
的裸眼检测。探针在单、双光子激发波长下均可以实现成像。实验证明在双光子激发下，探针在生物体内的成像更为清晰，在小鼠脑组织中的穿透深度可达391μm，且被证明可以应用于PD生物模型成像。在这些方面，PyFe探针的性能要优于现有的商业探针。

技术实现思路

[0006]本专利技术利用嘧啶基染料DEt的光学及生物性质，在其结构上引入了Fe
2+
特异性识别基团N
‑
O结构，进而达到精准检测活细胞内Fe
2+
的目的，亦可用于检测野生型及PD动物模型体内的Fe
2+
。
[0007]为了解决本专利技术的技术问题，提出的技术方案是：一种Fe
2+
双光子荧光探针，所述的荧光探针命名为PyFe，其结构式如下：
[0008][0009]优选的，探针的最佳吸收波长为360
‑
370nm，当探针与Fe
2+
反应后，吸收波长红移至470
‑
490nm，此时的发射波长为620
‑
640nm。
[0010]本专利技术中提及的Fe
2+
双光子荧光探针与Fe
2+
的反应机理如下：
[0011][0012]为了解决本专利技术的技术问题，提出的另一技术方案是：一种Fe
2+
双光子荧光探针的制备方法包括如下步骤：取适量溶剂溶解嘧啶基染料DEt后，冰浴条件下缓慢加入间氯过氧苯甲酸(m
‑
CPBA)，室温搅拌0.5
‑
3h，反应结束后旋干溶剂，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物PyFe荧光探针。
[0013]优选的，嘧啶基染料DEt、m
‑
CPBA的摩尔比为1：1
‑
1：10。
[0014]优选的，所述的嘧啶基染料DEt、m
‑
CPBA的摩尔比为1：2.2。
[0015]优选的，所述的嘧啶基染料DEt的制备方法如下：将4
‑
氟苯甲醛，碳酸钾，二乙基胺，Aliquat
‑
336溶解在DMF中，95℃搅拌12h。反应后的溶液用乙酸乙酯溶解，水洗涤。无水硫酸钠除水，硅胶层析法纯化得到DEt
‑
a。
[0016]将DEt
‑
a溶解在乙醇中，超声溶解固体，搅拌加入浓盐酸，95℃回流24h。反应结束后将溶液倒入冰水中，加入碳酸氢钠中和。用CH2Cl2萃取两次后无水硫酸钠干燥有机相，除去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析法得到染料DEt。
[0017]优选的，本专利技术一种Fe
2+
的双光子荧光探针的制备反应式如下：
[0018][0019]本专利技术采用的另一技术方案是：所述的一种Fe
2+
双光子荧光探针的应用，用于生理体系中精确检测生物体内的Fe
2+
的试剂制备。
[0020]优选的，所述试剂在细胞体系中通过双光子激发调控精确检测生物体内的Fe
2+
，而避免来自细胞中其他离子和氨基酸的干扰的应用。
[0021]优选的，所述的活细胞及动物组织为HepG2细胞株、LO2细胞株、斑马鱼胚胎、果蝇大脑和C57BL/6小鼠。
[0022]有益效果：
[0023]本专利技术的荧光探针具有近红外发射的优点，且具有双光子性，因此具有组织穿透能力强、光损伤弱和受组织自发荧光影响弱等优点，反应后荧光量子产率及双光子吸收截面显著增高。体外实验研究表明，探针与Fe
2+
反应速度快(<3min)，检出限低(0.04nM)，且具有肉眼可见的颜色变化。在生物条件(pH 7.4)下对Fe
2+
具有较高的灵敏度和选择性，不受其他离子和氨基酸的干扰。生物实验研究表明，探针对神经细胞毒性较低，并已成功在多种模式生物体内取得了良好的成像效果。该探针可以检测细胞和斑马鱼胚胎中外源和内源性Fe
2+
的水平。单、双光子荧光成像数据对比可发现，双光子激发特性可以提供更清晰的图像和更深的组织穿透深度。进一步将探针应用于PD动物模型中，实验证明探针可以直观地显示出PD果蝇脑组织和PD小鼠脑组织中内源性Fe
2+
水平。
[0024]图3：(a)10μM探针PyFe在DMSO中，与0
‑
100nM Fe
2+
反应的吸收光谱图；(b)10μM探针PyFe在DMSO中，与0
‑
100nM Fe
2+
反应的发射光谱图；(c)10μM探针PyFe与100nM Fe
2+
在DMSO中，可在3min内达到反应平台期；(d)46种不同离子及氨基酸对探针PyFe几乎无影响(1.Na
+
,2.K
+
,3.Mg
2+
,4.Al
3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Fe
2+
双光子荧光探针，其特征在于：所述的荧光探针为PyFe探针，PyFe荧光探针结构如式(I)所示：2.根据权利要求1所述的一种Fe
2+
双光子荧光探针，其特征在于：探针的最佳吸收波长为360
‑
370nm，当探针与Fe
2+
反应后，吸收波长红移至470
‑
490nm，此时的发射波长为620
‑
640nm。3.根据权利要求1所述的一种Fe
2+
双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：取适量溶剂溶解嘧啶基染料DEt后，冰浴条件下缓慢加入间氯过氧苯甲酸(m
‑
CPBA)，室温搅拌0.5
‑
3h，反应结束后旋干溶剂，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物PyFe荧光探针。4.根据权利要求3所述的一种Fe
2+
双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：嘧啶基染料DEt、m
‑
CPBA的摩尔比为1：1
‑
1：10。5.根据权利要求3所述的一种Fe
2+
双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的嘧啶基染料DEt的制备方法如下：将4
‑
氟苯甲醛，碳酸钾，二乙基胺，甲基三辛基氯化铵(Aliquat
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张承武，陆瑶，李林，吴越，徐家佳，王延宾，黄维，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：