用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用制造技术

本发明专利技术提供了用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，本发明专利技术还提供了上述DNA甲基化分子标记物的检测试剂盒和检测方法。所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是组合使用，可以进一步提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，提高恶性肺结节的检出率，降低检出的假阳性率。所述试剂盒中的引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，定量性能与单个区域定量等同。等同。等同。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用，所述应用包括检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]肺结节，即孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)是指影像为类圆形阴影、单一的、边界清楚的、直径小于或等于3cm、周围为含气肺组织所包绕的高低密度的实性或者亚实性病变，不伴肺不张、肺门肿大或胸腔积液。
[0003]肺结节分为良恶性两类，常无明显症状，良性结节需要针对病因治疗，恶性需要早期手术。良性的病因常与自身性免疫疾病或各种感染相关，恶性的病因常与肺癌相关。
[0004]肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。然而，在肺癌发生早期对病人进行治疗，是能够有效的提高其五年生存率。统计研究数据发现，I期肺癌患者在接受有效的治疗后，其五年生存率可达到60％～90％以上，而晚期肺癌患者的五年生存率却不足20％。因此，对早期癌症患者的诊断和治疗，显得尤为重要。目前，临床上使用的肺癌检测方法有：影像学检测、细胞学检测和分子标记物检测。
[0005]LDCT(低剂量螺旋CT)影像检测是常用的比较有效的早期肺癌筛查方法。该方法在不降低结节灶的发现率的前提下，将曝光剂量降至常规CT的10％～25％，对结节发现率的敏感性高。而LDCT并不能确定结节性质，导致4％～55％良性病灶过度治疗，假阳性率增高。在NLST试验中LDCT的阳性结果中有96.4％为假阳性。
[0006]临床上，肺癌早期诊断另一主要手段为常规痰脱落细胞学检查。肺癌表面脱落的癌细胞可随痰咯出，痰细胞学检查找到癌细胞可明确诊断，准确率可达80％以上，而痰细胞学早期肺癌的敏感性仅为20％～30％。因其敏感性受到肿瘤的位置、组织类型和痰标本留取正确与否的影响，同时也受病理科医生技术水平的影响，总体的检出阳性率偏低。
[0007]肺癌分子标记物检测的检测样本主要来源于组织活检和液体活检。组织样本主要通过外科手术或纤维支气管镜刷片直接从肿瘤部位取得，因此其检测的准确性更高，然而因组织活检具有一定的侵入性，肿瘤异质性的存在及由于种种原因而无法取得组织标本或者组织标本量不足以完成分子检测，使得组织活检在肺癌的早期诊断、预测转移以及预后等方面的作用存在一定的局限性。相对于组织活检，液体活检具有操作简便、非侵入性、重复性强和利于疾病的动态监测等优势。肺癌液体活检以患者的血液、痰液和肺泡灌洗液等为标本，对其中的肿瘤细胞DNA及其修饰水平，如DNA甲基化等，进行检测和分析。对于癌症患者，因其血液中的ctDNA含量很低且个体差异较大，提高灵敏性是该检测方法面临的一个巨大挑战。而痰液和肺泡灌洗液采集，临床可以通过雾化诱导咳痰收集痰液，以及纤维支气管镜获得肺泡灌洗液，因样本直接来源于肺部，在信号检测的灵敏度上会较血液样本更有优势。在样本采集方式上，痰液的收集为无创操作，更为安全；纤维支气管镜收集肺泡灌洗术(bronohoalveolarlavage,BAL)是利用支气管镜向支气管肺泡内注人生理盐水并随即吸出，收集肺泡表面有效液体，检查其细胞成分和可溶性物质的一种方法。相对于经皮肺穿刺
和外科手术活检是一类安全性较高的有创活检方法。
[0008]随着多层螺旋CT及高分辨CT的普及，以及人们健康意识的提高，越来越多的肺结节被检查出来，这对患者来说是好事，可以发现早期肺癌，但是对于患者也会造成很多困扰，甚至很多患者发现肺结节后会寝室难安，因此及时区分肺结节的良性或恶性及为重要。
[0009]目前可以确诊肺结节良恶性的主要是病理活检，但是病理活检是一种有创的操作，而且较小的结节不易通过穿刺活检取得标本，所以大部分的肺结节是通过结节大小、形态、密度，等来确定结节的良恶性。良性结节与恶性结节常常有不同的影像学表现，医生就是根据影像学的特点来判断肺结节的良恶性的，从而确定结节是否需要手术切除、或者进一步检查、或者是定期随访。
[0010]DNA甲基化与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程，由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且发生在癌前或者癌症早期阶段，因而是癌症诊断的理想标志物。
[0011]通过寻找基于肺癌呼吸道样本特异性DNA甲基化生物分子标记物，联合检测多个与肺癌相关的分子标记物，可增强肺癌的检出率，这对检测肺结节良恶性起到了关键作用。

技术实现思路

[0012]基于此，本专利技术提供一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物、检测试剂盒及方法，所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是其组合使用，对肺结节良恶性的检测具有很好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。
[0013]实现上述目的的技术方案包括以下。
[0014]一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。
[0015]在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.9所示序列，或包括SEQ ID NO.9的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。
[0016]在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9所示序列或其完全互补序列，或SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列；和
[0017]SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.21所示序列或其互补序列中的至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中至少一种。
[0018]在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9的序列；或为包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9的完全互补序列；或为包括SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。2.根据权利要求1所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9所示序列，或包括SEQ ID NO.9的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。3.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.9所示序列或其完全互补序列，或SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列；和SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.21所示序列或其互补序列中的至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中至少一种。4.根据权利要求3所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9的序列；或为包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9的完全互补序列；或为包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或为包括选自SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。5.根据权利要求2-4任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或包括选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或包括选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。6.根据权利要求2-5任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或还包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列全长的至少
55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。7.根据权利要求3所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的序列；或包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的完全互补序列；或包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。8.根据权利要求1—5任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为包括SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为包括SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。9.根据权利要求4或8所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列；或包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列的完全互补序列；或包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。10.根据权利要求2-9任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列全长的至少55％的连续片段，或为还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。11.根据权利要求1-10任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列；或为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列；或为所述DNA甲基化分子标记物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段；
或为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。12.根据权利要求1-11任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：以引物为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59、EQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.65中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.6中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.7中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.8中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.94和SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.9中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.10中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116、SEQ ID NO.118和SEQ ID NO.119中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.11中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124和SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.128中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.12中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.131、SEQ ID NO.133和SEQ ID NO.134、SEQ ID NO.136和SEQ ID NO.137中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.13中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.139和SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.142和SEQ ID NO.143、SEQ ID NO.145和SEQ ID NO.146中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.14中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.148和SEQ ID NO.149、SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152、
SEQ ID NO.154和SEQ ID NO.155中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.15中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.158、SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.161、SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.164中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.16中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.167、SEQ ID NO.169和SEQ ID NO.170、SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.173中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.17中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.176、SEQ ID NO.178和SEQ ID NO.179、SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.18中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185、SEQ ID NO.187和SEQ ID NO.188、SEQ ID NO.190和SEQ ID NO.191中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.19中所对应的序列；和/或，以引物为SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶竹佳，陶锦胜，陈志伟，范建兵，
申请(专利权)人：广州市基准医疗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：