用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鳙遗传多样性分析的双重PCR体系及应用，属于动物分子遗传学领域。本发明专利技术提供了4组鳙微卫星标记的双重PCR反应体系。利用本发明专利技术可以实现对鳙群体的遗传多样性分析，继而确定个体之间的亲缘关系，避免了群体之间近亲繁殖。本发明专利技术的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，并且本发明专利技术所消耗的财力和人力都比传统的PCR反应减少了一半，具有巨大的实用价值。大的实用价值。

【技术实现步骤摘要】
用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物及应用


[0001]本专利技术属于动物分子遗传学领域，涉及一种双重PCR微卫星引物及应用，尤其涉及一种用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物及应用。

技术介绍

[0002]鳙(学名：Aristichthys nobilis)俗称花鲢、胖头鱼、包头鱼、大头鱼、黑鲢、麻鲢、雄鱼，是中国特有淡水鱼类，也是中国四大家鱼之一，具有重要的经济价值。鳙的外形似鲢鱼，体型侧扁，头部较大且宽，口也宽大，且稍微上翘，眼位比较低。鳙生长在淡水湖泊、河流、水库、池塘里，喜栖居在水域的中上层。鳙是江湖洄游性鱼类，亲鱼性成熟时到江中产卵，产卵后仔稚鱼随水流进入沿江湖泊摄食肥育；待冬季湖泊水位回落时，又回到江河的深水区越冬。鳙产漂流性卵，性成熟为4～5龄，雄鱼最小为3龄，繁殖期在4～7月；喜在降雨天气，江水水位陡然上涨，水体流速明显加快时进行产卵。鳙人工繁育的催产季节多在5月初至6月中旬，一般3公斤以上的雌鱼便可达到性成熟。5公斤左右的雌鱼相对怀卵量约4～5万粒/千克，绝对怀卵量20～25万粒，产卵期与草鱼相近。在天然河流和湖泊等水体中，通常可见到10千克以上的个体，最大者可达50千克。在饲料充足的条件下，池塘养殖1龄鱼可重达0.8～1千克。初次性成熟个体体重大，部分地区达10千克以上，但在广西、广东地区，不足10千克的个体通常也可产卵。
[0003]微卫星标记是目前研究动物保护遗传学中最理想的一类方式，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。微卫星标记多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等优点。有关鳙的微卫星标记多重PCR国内外未见报道。

技术实现思路

[0004]为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种为鳙的选育工作提供了重要的研究基础且具有显著的推广价值的用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物及应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物，其特征在于：所述用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物包括如下4组引物序列：
[0007][0008]一种基于如前所述的用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物对鳙遗传多样性进行分析的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]1)取鳙组织样品并从鳙组织样品中提取鳙样品DNA；
[0010]2)利用如前所述的用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物对鳙样品DNA进行PCR扩增；
[0011]3)把步骤2)得到的PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，根据分离结果统计每个个体在所有微卫星位点中PCR扩增产物的基因型，根据各个个体的基因分型结果进行遗传多样性分析。
[0012]作为优选，本专利技术所采用的步骤2)中的PCR反应体系是25ul：10
×
PCR Buffer 2.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，2mmol/L MgCl
2 1.5ul，Taq酶0.4ul，DNA模板3ul，超纯水13.1ul以及每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul。
[0013]作为优选，本专利技术所采用的步骤2)中的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，退火温度57℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0014]作为优选，本专利技术所采用的步骤3)中是将步骤2)得到的PCR扩增产物用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。
[0015]如前所述的用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物在鳙的遗传多样性检测
时、在鳙个体识别时、在计算鳙个体之间亲缘关系的远近时以及在鳙选育时的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下的优点：
[0017]利用本专利技术提供的4组鳙微卫星标记的双重PCR反应体系可以实现对鳙的遗传多样性检测、个体识别，还可以计算个体之间的亲缘关系的远近，避免个体之间产生近亲繁殖，这为鳙的选育工作提供了重要的研究基础。并且本专利技术所提供的双重PCR方法消耗的财力和人力都比传统的PCR减少了一半，具有巨大的推广价值。本专利技术提供了4组鳙微卫星标记的双重PCR反应体系可以实现了对鳙群体遗传多样性分析，为鳙的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
附图说明
[0018]图1是双重PCR引物筛选扩增结果图；
[0019]图2是33个鳙个体之间的亲缘关系分析图。
具体实施方式
[0020]实施例1
[0021]鳙DNA的提取：
[0022]1.取33尾鳙，采集鳙的尾部肌肉，提取鳙的基因组DNA，提取方式采取传统的酚
‑
氯仿抽提途径。
[0023]1.1每个个体取0.1g尾鳍放于1.5ml的离心管内，剪碎，加入450μLSTE抽提缓冲液(10mmol/L Tris
‑
HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0)、35μL SDS(10％)、15μL蛋白酶K(0.2％)。
[0024]1.2将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明。
[0025]1.3在离心管内加入700ul Tris饱和酚，放在震荡机上混匀30分钟，4℃下12000r/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀)。
[0026]1.4在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1)，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。
[0027]1.5上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离10min，吸取上清液。
[0028]1.6加入
‑
20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀。
[0029]1.7用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μL TE(10mmol/LTris
‑
HCl，pH 8.0；0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)，室温充分溶解。检测DNA提取质量。
[0030]实施例2
[0031]鳙微卫星标记开发：
[0032]利用本课题组的鳙转录组数据，寻找微卫星序列，利用MISA软件寻找微卫星位点。寻找微卫星序列的原则为：重复序列至少重复6次，重复单位最少为2个碱基。在微卫星位点序列位置，利用Primer软件设计引物，微卫星的段串联序列包含在上下游引物之内。PCR产物的大小为100
‑
500bp，引物的长度为18
‑
24bp，退火温度为55
‑
60℃，设本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物，其特征在于：包括如下4组引物序列：2.一种基于如权利要求1所述的用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物对鳙遗传多样性进行分析的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：1)取鳙组织样品并从鳙组织样品中提取鳙样品DNA；2)利用如权利要求1所述的用于鳙遗传多样性分析的双重PCR微卫星引物对鳙样品DNA进行PCR扩增；3)把步骤2)得到的PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，根据分离结果统计每个个体在所有微卫星位点中PCR扩增产物的基因型，根据各个个体的基因分型结果进行遗传多样性分析。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的PCR反应体系是25ul：10
×
PCR Buffer 2.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，2mmol/L MgCl
2 1.5ul，Taq酶0.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶敏，黄强，李红涛，汤婷，陈仁峰，张宏，刘长明，彭海波，杨俊锋，李想，宋江腾，
申请(专利权)人：四川省能投攀枝花水电开发有限公司湖北省长江水生态保护研究院，
类型：发明
国别省市：