一种禾本科植物的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种禾本科植物的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)将禾本科植物种子萌发、长出第一张叶片后，拔出第一张叶片，此时叶鞘内形成一个杯状结构；(2)向步骤(1)杯状结构中加入具有用于基因编辑的重组载体的根癌农杆菌菌液；(3)继续培养，得到至少部分细胞被基因编辑的转基因植株。本发明专利技术基因编辑方法利用禾本科作物幼苗期解剖结构特征，直接在幼苗时期处理顶端分生组织的遗传转化技术，该技术可以省略组织培养过程，成本低、转化效率高。在苗期活体(营养体)上，利用禾本科作物解剖结构的特点，直接用农杆菌菌液感染植物顶端分生组织(SAM)、不需要经过组培阶段、不依赖基因型的遗传转化技术。传转化技术。传转化技术。

【技术实现步骤摘要】
一种禾本科植物的遗传转化方法


[0001]本专利技术涉及农业生物
，特别是涉及一种禾本科植物的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]植物遗传转化是现代科学中的一项重要技术进步，不仅促进人类对植物生理与发育过程的认知，而且开创了作物遗传改良的新纪元。然而对于许多农作物而言，有效的转化和再生仍然是一个很大的挑战。
[0003]现有技术中，植物遗传转化的方法主要有如下几种：(1)基于农杆菌介导的植物遗传转化技术，(2)基于基因枪质粒轰击介导的植物遗传转化技术，(3)基于生物活性珠(藻酸钙珠)介导的植物遗传转化，(4)基于花粉及花粉生长通道介导的植物遗传转化，(5)基于碳化硅丝介导的植物转化技术，(6)基于电击穿孔介导的植物遗传转化，(7)基于显微注射介导的植物遗传转化技术，(8)基于调控顶端分生组织发育的遗传转化方法。
[0004]CRISPR
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Cas系统是在原核细菌和古细菌中进化产生的RNA引导的适应性免疫反应，用以抵御诸如病毒、转座子和质粒之类的外来遗传因素的侵害。目前CRISPR/Cas9介导的基因组编辑已经在多个模式植物以及水稻、烟草、小麦、大麦、双色高粱、玉米、玉米、茄子、马铃薯、油菜、大豆、莴苣、黄瓜、柑橘、毛白杨、金银花等物种上取得成功，然而CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术也要依赖后续包括组织培养在内的遗传转化技术，而组织培养对于许多物种而言，难度极大。
[0005]总而言之，无论是DNA重组还是基因编辑技术，都迫切需要简便、实用、高效率、低成本的遗传转化技术。随着合成生物学的快速发展，用于精确基因组编辑和基因整合的新型载体系统的研发，有可能带来作物遗传改良革命性的进步，为农业的可持续发展展示了美好的前景。因此，不依赖物种(或基因型)的、高效植物遗传转化技术将是下一阶段作物遗传改良的主攻方向之一。
[0006]植物遗传转化是应用重组DNA技术或者基因编辑技术，通过细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中/或对受体基因组进行定点编辑，经过减数分裂获得基因组受到修饰之后的新植株的技术。无论是基于CRISPR/Cas9或其它核酸酶的基因编辑技术，还是基于DNA重组的转基因技术，植物遗传转化(transformation)都是达到基因编辑或者转基因目的不可或缺的关键步骤之一。
[0007]对于水稻、玉米、小麦、大麦等禾本科粮食作物的遗传转化实践，目前通行的技术是通过农杆菌感染(或者用基因枪DNA质粒轰击)胚、下胚轴、子叶外植体、顶端分生组织等分生能力强的组织，然后通过对愈伤组织的培养来获得(转基因或者受到基因编辑)再生苗。目前的方法具有以下的局限性：(1)组培技术高度依赖物种与基因型，水稻中的籼稻亚种、大麦与小麦的转化效率都非常低；(2)组培过程对环境洁净度的要求非常苛刻，培养基的配置、植物组织的前处理、暗培养/光培养、培养器皿的更换等环节，稍有不慎就会受到污染；(3)组培空间的建设成本和维护成本均较高，能耗较高；(4)组培过程比较耗时间，经过组培得到成苗并开花结籽，比正常种子萌发到开花结籽时间上长3
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6个月。

技术实现思路

[0008]本申请针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种新的植物遗传转化技术，克服禾本科粮食作物(水稻、玉米、小麦、大麦等)等四种作物遗传转化技术难度大(转化效率低)、周期长、且依赖物种种类与基因型缺点，省去遗传转化过程中的组织培养步骤，创建一种简单易操作、不依赖基因型、低成本、高效率的禾本科作物遗传转化方法。
[0009]一种禾本科植物的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0010]1)将禾本科植物种子萌发、长出第一张叶片后，拔出第一张叶片，此时叶鞘内形成一个杯状结构；
[0011]2)向步骤1)杯状结构中加入具有用于基因编辑的重组载体的根癌农杆菌菌液；
[0012]3)继续培养，得到至少部分细胞被遗传转化的植株。
[0013]优选的，所述禾本科植物为水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、小黑麦、高梁、甘蔗等。由于本申请禾本科植物遗传转化方法是通过种子萌发后第一张叶片长出后将第一张叶片拔掉，此时叶鞘内形成一个杯状结构，由于禾本科植物都存在类似的结构，所以，可以推广应用到所有的禾本科植物。
[0014]优选的，步骤1)中，种子萌发3～5天时长出第一张叶片，然后拔出第一张叶片。
[0015]优选的，步骤2)中，用于由于遗传转化的载体为双元载体。双元载体可以是常用的农杆菌转基因时用的质粒，比如质粒pTX172。重组载体的构建以及重组载体转入农杆菌的方法均可以使用现有技术中常规的方法。
[0016]菌液量可以根据不同种类的植株以及培养条件情况确定。优选的，步骤2)中，向步骤1)杯状结构中加入的菌液量为15～30μL。更优选的，步骤2)中，向步骤1)杯状结构中加入菌液到加满。向杯状结构中尽可能多地加入菌液，这样可以提高转化效率。
[0017]优选的，步骤(1)种子萌发阶段在黑暗条件下进行或者光照条件下进行。
[0018]本申请基于此遗传转化的方法，由于在植株种子萌发长出第一片叶子后才加入转基因用的农杆菌菌液，所以，后续植株生长过程中，从杯状结构底部的茎尖顶端分生组织新生长出的茎、叶中细胞容易被转化，但也并不一定全部都能够受到遗传修饰，所以，可能继续培养后得到的植株是一种嵌合体。如果需要获得遗传背景一致的纯合体(homozygote)或者杂合体(heterozygote)，则可以通过后代遗传分离群体的选择。
[0019]本申请描述的是一种利用禾本科作物幼苗期解剖结构特征，直接在幼苗时期处理顶端分生组织的遗传转化技术，是一种在苗期活体(营养体)上，利用禾本科(水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、黑麦、小黑麦等)作物解剖结构的特点，直接用农杆菌菌液感染植物顶端分生组织(SAM)、不需要经过组培阶段、不依赖基因型的遗传转化技术，成本低、效率高，简单易行。
附图说明
[0020]图1为用于基因编辑的载体左边界与右边界之间的序列构建。示意该载体的核心元件PolII启动子、Cas9核酸蛋白基因、PolyA、核糖酶剪切序列、sgRNA1、sgRNA2，核糖酶终止序列之间的位置关系。箭头所指，示核糖酶剪切序列位置；RZ，Ribozyme terminator，示核糖酶终止序列。
[0021]图2为经ICCU法遗传转化处理之后，OsPDS基因受到编辑的水稻幼苗。(A)粳稻品种
日本晴(Nipponbare)；(B)籼稻品种卡萨拉斯(Kasalath)。白色箭头所示为白化苗。
[0022]图3为水稻PDS基因的目标区域受到编辑的状况(日本晴)，其中，＃后面的数字代表转化株代码；a1
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a18代表基因编辑创造的等位变化，A0代表日本晴原来的等位基因碱基序列；Ho，代表两条DNA链呈纯合状态；Bi，代表两条DNA链均受到编辑而出现新的等位类型；He，代表两条DNA链呈杂合状态；减本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禾本科植物的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将禾本科植物种子萌发、长出第一张叶片后，拔出第一张叶片，此时叶鞘内形成一个杯状结构；2)向步骤1)杯状结构中加入具有用于遗传转化的载体质粒的根癌农杆菌菌液；3)共培养，得到至少部分顶端分生组织细胞基因组被修饰的转化植株。2.如权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述禾本科植物为水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、黑麦、小黑麦、狗尾草或甘蔗。3.如权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤1)中，种子萌发3～5天时长出第一张叶片，然后拔出第一张叶片。4.如权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋立希，朴学成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：