利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法制造技术

本发明专利技术公开了一种同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。本发明专利技术还同时提供了利用pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3‑

【技术实现步骤摘要】
利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体包括在整个植物中同时快速、高含量表达2种非融合外源蛋白的植物病毒表达载体构建方法。

技术介绍

[0002]随着大量植物基因组测序的完成，迫切需要一个好的载体或技术来快速地分析基因组中新基因或预测蛋白的生物学功能。目前，研究功能未知的基因或蛋白是最主要通过转基因技术在植物中表达目的蛋白以证实其功能，但转基因操作繁琐、周期长及物种限制等制约因素，目前利用植物病毒表达载体探究蛋白的生物学功能也日益成为一种趋势。
[0003]病毒复制/翻译效率高在植物中产生大量病毒蛋白，并且基因组小易操，大量植物病毒被用作构建外源蛋白表达载体的来源。绝大多数植物病毒载体是表达单个外源蛋白，马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)外源蛋白表达是是目前最常用病毒表达载体，其构建策略为在病毒的基因组中插入相同病毒或同一属病毒不同成员的外壳蛋白(coat protein，cp)基因启动子序列来驱动外源基因的mRNA转录，利用病毒亚基因组翻译策略表达目的蛋白，在PVX基因组中cp启动子序列前面插入不同病毒cp基因启动子序列用来驱动表达2个外源蛋白。目前，越来越多的植物病毒用于构建表达多个外源蛋白的载体，其构建的原理是：病毒多聚体蛋白水解策略和肽酶切割病毒融合蛋白原理，将外源蛋白基因序列插入到病毒的2个开放阅读框(open reading frame，ORF)之间，利用病毒多聚体蛋白水解翻或肽酶切割译策略在植物中表达目的蛋白，如，采用大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)构建的双基因表达载体及将外源基因插入P1/HC
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Pro、HC
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Pro/NIb和NIb/CP之间的马铃薯病毒A(Potato virus A,PVA)三基因表达载体。由烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)构建载体pT2C2AGFP表达绿色荧光蛋白(GFP)，在本氏烟中能有效地表达5种含有GFP的蛋白(MP
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GFP
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2A
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CP、MP
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GFP
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2A、GFP
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2A
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CP、GFP
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2A和GFP)，但4种融合蛋白(MP
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GFP
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2A
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CP、MP
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GFP
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2A、GFP
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2A
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CP和GFP
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2A)为主要成分，而游离的GFP含量极少。基于病毒多聚体蛋白水解策略和肽酶切割病毒融合蛋白策略所构建的表达载体，在寄主植物中所产生的目的蛋白均含有源于病毒蛋白或肽酶的氨基酸残基。上述两种植物病毒表达载体构建原理均是在病毒的基因组插入外源序列，影响病毒基因组的完整性，造成病毒基因组的不稳定(重组、突变或缺失)使得其外源序列在病毒复制、包被或移动过程中被丢失，目的蛋白不能得到有效表达。
[0004]烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)是烟草脆裂病毒属(Tobravirus)的典型成员，寄主范围泛，能侵染超过50种单子叶和双子叶家族的400多种植物。TRV为正义单链RNA(+single strand RNA，+ssRNA)病毒，基因组由RNA1和RNA2分子组成；RNA1所编码4个蛋白参与病毒的复制、移动及症状产生，RNA2中包含3个ORF，编码外cp、27kDa的2b和18kDa的2c，TRV中2b和2c基因完全缺失，病毒还能在植物中的复制、移动和。传播。TRV寄主范围广泛，引起的症状反应相对温和，目前被应用于构建病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)载体和表达单个外源蛋白载体。
[0005]目前国内外利用植物病毒编码多聚蛋白的水解酶特性或肽酶2A自我切割所构建的多个蛋白的表达载体，在植物中所产生的外源蛋白均包含一段来源于非目的蛋白的氨基酸残基，目的蛋白的N端或C端携带其它蛋白的氨基酸残基可能干扰其生物学功能。
[0006]专利技术人所在团队早期申请的专利技术《同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用》(申请号201810261990.2)告知了：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒cp基因启动子的载体pTRV2e2，通过2个亚基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。该方案尚存在的不足之处是：载体pTRV2e2中TRV基因组RNA2包含2个cp基因的启动子，而采用双cp基因亚基因组启动子策略所构建的病毒外源蛋白表达载体，外源引入的cp基因启动子影响病毒基因组结构的完整性，容易在寄主植物中发生重组、突变或丢失，使得病毒外源蛋白表达载体在侵染后期或者病毒汁液摩擦转接过程中目的表达表达量低或不能表达外源蛋白。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种同时快速、高含量表达两个外源蛋白载体TRVe3的构建方法。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。
[0009]即，本专利技术通过TRV基因组RNA2中的2个亚基因组启动子产生表达外源蛋白的mRNA，并利用植物的翻译系统快速、高含量地表达出2个目的蛋白，pTRV2e3中基因组RNA2的序列如SEQ ID NO:3所述。
[0010]作为本专利技术的同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法，利用重组质粒pTRV2e1，在pTRV2e1插入TRV的2c基因亚基因组启动子序列和多克隆位点2(MCS2)获得含有多克隆位点MCS1和MCS2的载体pTRV2e3。
[0011]本专利技术还同时提供了利用上述pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3‑
rfp
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gfp的方法，包括以下步骤：
[0012]1)、PCR扩增绿色蛋白基因(gfp)并通过双酶切连接至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3‑
gfp
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MCS2；
[0013]2)、以pTRV2e3‑
gfp
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MCS2为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e3中，获得载体pTRV2e3‑
MCS1
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gfp；
[0014]3)、PCR扩增红色蛋白基因(rfp)并通过双酶切克隆至pTRV2e3‑
MCS1
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gfp，获得到载体pTRV2e3‑
rfp
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法，其特征是：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。2.根据权利要求1所述的同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法，利用重组质粒pTRV2e1，其特征是：在pTRV2e1插入TRV的2c基因亚基因组启动子序列和多克隆位点2获得含有多克隆位点MCS1和MCS2的载体pTRV2e3。3.利用如权利要求1或2所述的pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3‑
rfp
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gfp的方法，其特征是包括以下步骤：1)、PCR扩增绿色蛋白基因(gfp)并通过双酶切连接至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3‑
gfp
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MCS2；2)、以pTRV2e3‑
gfp
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MCS2为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e3中，获得载体pTRV2e3‑
MCS1
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gfp；3)、PCR扩增红色蛋白基因(rfp)并通过双酶切克隆至pTRV2e3‑

【专利技术属性】
技术研发人员：廖乾生，郭歌，常发光，赖家良，杜志游，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：