一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用，该单加氧酶突变体是将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列自N端第1位至X位氨基酸残基替换为SEQ ID No.2所示氨基酸序列第1位至X位氨基酸残基所形成的蛋白质，其中X为125

【技术实现步骤摘要】
一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种单加氧酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，所述单加氧酶突变体的制备，以及所述单加氧酶突变体在(S)
‑
奥美拉唑合成中的应用。

技术介绍

[0002]手性亚砜如(S)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
[[(4
‑
甲氧基
‑
3,5
‑
二甲基
‑2‑
吡啶基)甲基]亚磺酰基]‑
1H
‑
苯并咪唑((S)
‑
奥美拉唑，也称埃索美拉唑)是治疗胃食管反流性疾病的质子泵抑制剂。临床研究表明，只有(S)
‑
构型的亚砜具备治疗效力，因而这类拉唑类药物的光学纯度对药物的药效有极其重要的影响。潜手性硫醚的不对称氧化是合成该类手性亚砜的重要制备方法。目前工业上制备亚砜常采用金属不对称氧化法(WO9118895；JP9971370)，但是也存在较多问题。例如，催化过程中用到大量的金属催化剂，过氧酸和有机溶剂对操作人员和环境影响较大；后处理工艺中用到萃取、干燥、过滤、浓缩等操作，操作较为繁琐；后处理过程中产生较多的三废；且化学催化剂常催化亚砜过度氧化为砜，而副产物砜的分离和去除是非常困难的。
[0003]生物催化硫醚的不对称氧化具备反应条件温和、化学及立体选择性高，仅产生副产物水等优点，近些年来成为新兴的手性亚砜绿色合成途径。在现有的生物催化不对称氧化硫醚产生亚砜的工具酶中，Baeyer
‑
Villger单加氧酶(BVMO)是催化亚砜合成研究较多的一类酶，拥有高度的选择性和广泛的底物谱，在合成高附加值化学品、手性砌块以及大宗化学品等方面具有潜在的应用价值(ACS Catal.2019,9,11207
‑
11241)。尽管天然BVMO对部分小位阻硫醚具备一定的活力和较优的立体选择性，但对于潜手性大位阻拉唑硫醚如奥美拉唑硫醚则没有活力或仅产生无效构型的产物(Appl.Microbiol.Biotechnol.2021,105,3169
–
3180)。
[0004]本申请专利技术人通过基因挖掘的方法获得了来源于醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的环己酮单加氧酶(AcCHMO)，随后采用基于结构的理性设计和定向进化改造等多种策略，获得突变体AcCHMO
V6
，实现了该酶底物偏好性由环己酮向奥美拉唑硫醚的偏转(ACS Sustainable Chem.Eng.2019,7,7218
‑
7226；Biotechnol.Bioeng.2020,118,1
–
8；Mol.Catal.2021,509,111625)，并实现了反应的中试过程放大(Org.Process Res.Dev.2020,24,1124
‑
1130)。
[0005]尽管生物催化奥美拉唑硫醚不对称氧化已经取得了一定的进展，但目前已有的BVMO整细胞催化奥美拉唑硫醚氧化活力相对较低，在催化过程中通常需要将大肠杆菌胞内表达的单加氧酶纯化制备为纯酶以求提高添加量，操作繁琐；或需要将细胞破碎制备为粗酶液，由于粗酶液含有较多胞内杂质如核酸等，反应后处理萃取过程存在严重的乳化。另一方面，由于大肠杆菌本身为条件致病菌，其细胞膜含有内毒素，限制了其在目标反应产物为食药相关分子生产中的应用。作为发展成熟的食药安全宿主，毕赤酵母(Pichia pastoris)具有生长周期短，易于大规模高密度发酵、对蛋白具备简单的翻译后修饰和成熟的跨膜分
泌系统等优势。目前，尚无任何利用毕赤酵母分泌表达BVMO的报道。

技术实现思路

[0006]针对目前已知的具备大位阻拉唑硫醚氧化活力的单加氧酶只能在大肠杆菌胞内表达的问题，本专利技术提供一种可以分泌表达单加氧酶的毕赤酵母重组菌株；并针对AcCHMO
V6
在毕赤酵母分泌水平过低的问题，提供新型单加氧酶突变体及其编码基因序列，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，可高效分泌表达该单加氧酶突变体的重组毕赤酵母转化体培养物的制备方法，以及该单加氧酶突变体或重组转化体培养物在催化大位阻芳香醛拉唑硫醚不对称氧化中的应用。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]本申请专利技术人将AcCHMO
V6
及文献报道的经典黄素单加氧酶(CHMO
Aciento
,Eur J Biochem 1976,63,175
‑
192)基因导入毕赤酵母后发现，AcCHMO
V6
在毕赤酵母酵母的分泌上清中表达量极低，而CHMO
Aciento
实现了较高的表达水平。遗憾的是CHMO
Aciento
本身并无催化拉唑硫醚的活力。
[0009]其中，AcCHMO
V6
的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，对应的碱基序列如SEQ ID No.4所示；
[0010]CHMO
Acineto
的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
[0011]本专利技术采取的技术方案之一是：
[0012]本专利技术的提供一种单加氧酶嵌合突变体，即提供一种分离的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：
[0013](a)将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列自N端第1位至X位氨基酸残基替换为SEQ ID No.2所示氨基酸序列第1位至X位氨基酸残基所形成的蛋白质，其中X为125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135；
[0014](b)将(a)中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，单加氧酶嵌合突变体为将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前130位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前130位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，命名为AcCHMO
H6
，对应的碱基序列如SEQ ID No.6所示。
[0016]在本专利技术的一个实施方式中，进一步，本专利技术提供多种较佳的单加氧酶突变体，其是由下述任一氨基酸序列组成的蛋白质：
[0017](1)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸；
[0018](2)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸；
[0019](3)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第111位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列自N端第1位至X位氨基酸残基替换为SEQ ID No.2所示氨基酸序列第1位至X位氨基酸残基所形成的蛋白质，其中X为125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135；(b)将(a)中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。2.根据权利要求1所述的一种单加氧酶突变体，其特征在于，所述单加氧酶突变体是将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位、第14位、第43位、第55位、第71位、第111位、第120位的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。3.根据权利要求2所述的单加氧酶突变体，其特征在于，所述单加氧酶突变体是由下述任一氨基酸序列对应的蛋白质：(1)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸；(2)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸；(3)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸；(4)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸；(5)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸；(6)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，李亚静，郑宇璁，许建和，潘江，秦鹏，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：