一种用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAPDH分子抗原多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，提供了一种用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAPDH分子抗原多肽，所述GAPDH分子抗原多肽包含巴氏杆菌GAPDH表位，其氨基酸序列为如下三段序列之一，PMG

【技术实现步骤摘要】
一种用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAPDH分子抗原多肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种巴氏杆菌保护性抗原的特异性氨基酸序列及其应用。

技术介绍

[0002]巴氏杆菌病（pasteurellosis）主要由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）引起，是多种畜禽、野生动物和人类的一种传染病的总称。巴氏杆菌病呈地方流行性，会造成动物死亡或影响其生长、降低饲料报酬，给畜禽养殖业带来较大经济损失。巴氏杆菌病因发病程度和感染动物不同而有不同的病名，如猪肺疫、猪进行性萎缩性鼻炎、禽霍乱、牛出血性败血症、兔巴氏杆菌病（兔出血性败血症）等，其中多数疫病被中国政府列为二类动物疫病。近年来巴氏杆菌的在多种动物中的临床分离或检出率都位居前列。多杀性巴氏杆菌同样可以造成人类感染发病，是一种人兽共患病病原体。
[0003]巴氏杆菌的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶（GAPDH）具有免疫保护效应，并且具有高度保守的特点，是良好的亚单位疫苗研制候选抗原。由于GAPDH是一种糖酵解酶，在其他细菌中也存在结构相似的分子，未进行免疫的猪的血清中容易出现能够与巴氏杆菌GAPDH分子发生交叉反应的抗体，因而难以建立起一种高度特异性的血清抗体检测方法以评估巴氏杆菌GAPDH抗原的免疫效果。因而寻找巴氏杆菌GAPDH特异性序列进而建立起高度特异性的血清抗体检测方法就成为有效利用巴氏杆菌GAPDH抗原的必然要求。
[0004]本专利技术的目的是通过鉴定巴氏杆菌GAPDH分子的抗原表位，从而获得一种建立GAPDH血清抗体特异性检测方法所需的抗原氨基酸序列。

技术实现思路

[0005]本专利技术所解决的技术问题是：通过鉴定巴氏杆菌GAPDH的表位获得一种高度特异性氨基酸序列，从而能够建立检测巴氏杆菌GAPDH血清抗体水平的特异性检测方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：提供了一种用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAPDH分子抗原多肽，所述GAPDH分子抗原多肽包含巴氏杆菌GAPDH表位，该表位对应如下三段氨基酸多肽序列之一，PMG
‑
2A：HATTATQKTVDGPSAKDWRGGRGA；PMG
‑
2B：TQKTVDGPSAKDWRGGRGAAQNIIP；PMG
‑
2D：KDWRGGRGAAQNIIPSSTGA。
[0007]上述GAPDH分子抗原多肽可在特异性检测巴氏杆菌方面得到应用。
[0008]上述GAPDH分子抗原多肽在评估GAPDH抗原免疫效果方面得到应用。，上述用于血清抗体检测巴氏杆菌的GAPDH分子抗原多肽的制备方法，步骤如下所示：使用固相肽合成法合成表位多肽PMG
‑
2A、PMG
‑
2B和PMG
‑
2D，即依次向树脂中添加氨基酸以构建肽链；当合成完成后，首先去保护N
‑
端的Fmoc基团，然后去保护侧链保护基团，最后将多肽从树脂上切割下来；粗肽液样品溶解后，注入高效液相色谱仪，对色谱中出现的每个部分进行分子量和纯度测试，以确认目标多肽含量。
[0009]本专利技术的有益效果是：与现有技术相比，尽管目前现有技术可以使用巴氏杆菌GAPDH分子重组蛋白为抗原检测GAPDH分子免疫后血清抗体产生情况，但是由于不同细菌中都有GAPDH分子，不同细菌GAPDH的抗体可能具有交叉反应性，目前技术所采用技术手段所建立的检测方法的特异性较差，难以有效检测巴氏杆菌GAPDH的免疫效果。本专利技术通过解析GAPDH抗原表位找到了能与巴氏杆菌GAPDH抗体发生特异性反应的一段多肽序列，该多肽与猪场常见细菌免疫血清均不发生反应，具有高度的特异性，可以用于建立评估巴氏杆菌GAPDH免疫后血清抗体水平的检测方法。
附图说明
[0010]图1为巴氏杆菌GAPDH各氨基酸残基构成表位能力及线性B细胞表位预测结果 使用在线软件Bepipred
‑
2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope
‑
prediction
‑
vr.html），所分析的序列为C51
‑
17株的GAPDH序列；图2 为所预测到的表位在巴氏杆菌GAPDH分子上的位置 图中氨基酸序列为巴氏杆菌C51
‑
17株GAPDH的一级结构，本研究所预测到的抗原表位已经用下划线标出；图3为间接ELISA法检测多肽与高免血清之间反应的结果；图4 为间接ELISA法检测多肽与猪场常见细菌免疫血清之间的反应情况。A，包被抗原为巴氏杆菌GAPDH重组蛋白；B，包被抗原为PMG
‑
2B多肽。
具体实施方式
[0011]为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。
[0012]实施例1巴氏杆菌GAPDH抗原表位预测（1）基因序列来源本专利技术首先分析了已经完成基因组测序的巴氏杆菌的基因组数据中的巴氏杆菌GAPDH氨基酸序列：C51
‑
17 (A型，NZ_MAPQ01000003.1)、PMTB2.1 (B型，NZ_CP007205)、HN06 (D型，NC_017027)、Pm70 (F型，NC_002663)。所有序列从自美国国立生物技术信息中心数据库NCBI
‑
GenBank 公共数据库中获得。
[0013]（2）生物材料及主要试剂所有高免血清均在以前的实验中已经制备并保存。ELISA板购自美国Costar公司，HRP鼠二抗购自Biosharp公司，TMB单组分显色液购自湖州英创生物科技有限公司。
[0014]（3）不同菌株GAPDH氨基酸序列的比较 使用在线软件Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）完成多序列比对，比较（1）中不同巴氏杆菌GAPDH氨基酸序之间的相似性。通过多序列比较发现巴氏杆菌不同血清型菌株C51
‑
17、PMTB2.1、HN06、Pm70的GAPDH氨基酸序列高度保守，仅HN06发生了A288T一处点突变（未展示多序列比对结果），显示出巴氏杆菌GAPDH具有高度保守的特点。
[0015]（4）巴氏杆菌GAPDH表位预测 使用在线软件Bepipred
‑
2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope
‑
prediction
‑
vr.html）分析巴氏杆菌GAPDH分子（C51
‑
17株）上各个氨基酸残基构成表位的能力。以软件默认的0.5为阈值，高于此阈值且有较长连续序列的一段多肽被预测为GAPDH分子的线性B细胞表位。所预测的巴氏杆菌GAPDH线性B细胞表位的分布状况如图1所示。有多段连续序列高于软件默认的阈值0.5，后续实验选择本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAPDH分子抗原多肽，其特征在于，所述GAPDH分子抗原多肽包含巴氏杆菌GAPDH表位，该表位对应如下三段氨基酸多肽序列之一，PMG
‑
2A：HATTATQKTVDGPSAKDWRGGRGA；PMG
‑
2B：TQKTVDGPSAKDWRGGRGAAQNIIP；PMG
‑
2D：KDWRGGRGAAQNIIPSSTGA。2.权利要求1所述用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAPDH分子抗原多肽在特异性检测巴氏杆菌方面的应用。3.权利要求1所述用于血清抗体检测的巴氏杆菌GAP...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱伟峰，陈露，谭凯，王高杰，蔡承志，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：