一种细胞色素P450BM3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞色素P450BM3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用，所述细胞色素P450BM3突变体选自：突变体LG

【技术实现步骤摘要】
一种细胞色素P450 BM3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用


[0001]本专利技术属于生物催化酶
，具体涉及一种细胞色素P450 BM3突变体及其在醋酸群勃龙合成中的应用。

技术介绍

[0002]甾体激素类药物是世界上仅次于抗生素的第二大类药物，广泛应用于治疗炎症、心血管疾病、肿瘤、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等疾病。我国天然甾体资源丰富，生产规模、产品质量已接近世界先进水平，但甾体药物研发技术水平仍有一定的差距，主要原因是甾体药物的合成步骤繁琐，反应复杂，基团的远程效应十分明显，收率低，特别是分离纯化困难。
[0003]甾体激素按生理活性可分为三大类：蛋白同化激素、肾上腺皮质激素和性激素。其中蛋白同化激素俗称合成类，是一类拟雄性激素的人工合成的甾体激素，通过对雄性激素进行结构改造，从而降低雄激素活性，提高蛋白同活性，且用药后易吸收，血中浓度高，体内活性大，具有多种作用。醋酸群勃龙属于蛋白同化素的一种，在临床上应用广泛，它能迅速增加肌肉力量和围度，提高肌肉质量。此外，醋酸群勃龙可预防疯牛病，国内外市场需求量日益增大。
[0004]传统醋酸群勃龙的生产工艺以4，9(11)
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二烯雄甾3
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17
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二酮为原料，以对甲苯磺酸或乙酰氯为催化剂，对3
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位羰基进行保护，再采取还原、脱氢进行、水解得到群勃龙；最后群勃龙和乙酸酐进行酯化反应，得到群勃龙醋酸酯。然而该路线副产物多，质量低、收率低，不利于大规模生产应用。
[0005]现有技术公开了一种以4，9物(雌甾
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4,9
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二烯
‑
3,17
‑
二酮，CAS：5173
‑
46
‑
6)为原料，通过3位二甲基醚化、17位还原、3位水解、11,12位脱氢、17位酯化，共5步化学反应，制备醋酸群勃龙的方法，然而该生产路线中使用的乙酰氯，有强烈刺激性和腐蚀性，加水终止反应后生成醋酸，废水很难处理，且后续还原水解反应都是反应终止后溶剂替换，多次水洗，操作复杂且废水量非常大，并且收率不高，其总收率为63.1％。
[0006]专利CN108017682A公开了一种醋酸群勃龙的合成方法，其在现有技术的基础上经脱氢和酯化即可得到醋酸群勃龙，通过优化反应路线和条件，得到一条新的醋酸群勃龙的合成路线。然而该专利采用的化学合成路径仍存在存在步骤繁琐，效率低，反应复杂，副产物多且提纯分离困难等问题，还会产生大量污染废弃物。因此如何提高反应选择性，减少副产物，并维持温和的反应条件以及低成本，是目前亟待解决的重要难题。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种对雌甾
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4,9
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二烯
‑
3,17
‑
二酮(4,9物)和甲基双烯醇酮具有11α羟基化作用的P450 BM3突变体酶，从廉价易得的4,9物出发，使用P450 BM3突变体酶和17β羟类脱氢酶(17β
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HSD酶)一步法催化4,9物生成11α
‑
羟基甲基双烯
醇酮，并使用GDH酶进行辅因子NADPH的再生和循环，进一步结合化学催化反应生成醋酸群勃龙。生物酶催化的选择性高，副产物少，反应条件温和，成本低廉，绿色环保高效，通过将生物酶催化和化学催化结合，可更高效快速地合成醋酸群勃龙。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术的目的之一在于提供一种细胞色素P450 BM3突变体，，所述细胞色素P450 BM3突变体选自：突变体LG
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23/T438S，LG
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23/T438A和/或LG
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23/T438G，所述突变体LG
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23/T438S的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述突变体LG
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23/T438A的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述突变体LG
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23/T438G的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]进一步地，所述突变体LG
‑
23/T438S，LG
‑
23/T438A和LG
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23/T438G是在突变体LG
‑
23的基础上，分别将第438位的苏氨酸突变为丝氨酸，丙氨酸和甘氨酸。
[0011]本专利技术的目的之二在于提供了一种编码所述细胞色素P450 BM3突变体的的基因，所述突变体LG
‑
23/T438S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述突变体LG
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23/T438A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述突变体LG
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23/T438G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]本专利技术的目的之三在于提供了一种载体，所述载体中包含上述细胞色素P450 BM3突变体的的基因。
[0013]本专利技术的目的之四在于提供了一种细胞，所述细胞中包含上述载体。
[0014]本专利技术的目的之五在于提供了所述细胞色素P450 BM3突变体，或所述突变体LG
‑
23，或上述载体，或上述细胞在催化甾体化合物11α羟基化中的应用。
[0015]进一步地，所述甾体化合物包括但不限于雌甾
‑
4,9
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二烯
‑
3,17
‑
二酮和/或甲基双烯醇酮。
[0016]本专利技术的目的之六在于提供了所述细胞色素P450 BM3突变体，或所述突变体LG
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23，或上述载体，或上述细胞在醋酸群勃龙合成中的应用。
[0017]本专利技术的目的之七在于提供了一种醋酸群勃龙的合成方法，包括以下步骤：
[0018]步骤1、将雌甾
‑
4,9
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮在所述细胞色素P450 BM3突变体或所述突变体LG
‑
23、以及17β羟类脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的作用下，生成11α
‑
羟基甲基双烯醇酮；
[0019]步骤2、将所述11α
‑
羟基甲基双烯醇酮与一水合对甲基苯磺酸反应，并用三氯甲烷萃取得到群勃龙；
[0020]步骤3、将所述群勃龙与4
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二甲氨基吡啶和醋酐进行酯化反应，制得醋酸群勃龙。
[0021]进一步地，步骤1具体为：将共表达或分别表达细胞色素P450 BM3突变体和17β羟类脱氢酶的遗传工程菌，用缓冲液溶解，加入葡萄糖脱氢酶、底物雌甾
‑
4,9
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮、辅因子NADP
+...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞色素P450 BM3突变体，其特征在于，所述细胞色素P450 BM3突变体选自：突变体LG
‑
23/T438S，LG
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23/T438A和/或LG
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23/T438G，所述突变体LG
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23/T438S的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述突变体LG
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23/T438A的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述突变体LG
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23/T438G的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.根据权利要求1所述的细胞色素P450 BM3突变体，其特征在于，所述突变体LG
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23/T438S，LG
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23/T438A和LG
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23/T438G是在突变体LG
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23的基础上，分别将第438位的苏氨酸突变为丝氨酸，丙氨酸和甘氨酸。3.一种编码权利要求1中所述细胞色素P450 BM3突变体的基因，其特征在于，编码所述突变体LG
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23/T438S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，编码所述突变体LG
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23/T438A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述突变体LG
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23/T438G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。4.一种载体，其特征在于，所述载体中包含如权利要求3所述的编码细胞色素P450 BM3突变体的基因。5.一种细胞，其特征在于，所述细胞中包含如权利要求4所述的载体。6.如权利要求1所述的细胞色素P450 BM3突变体，或如权利要求2中所述的突变体LG
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23，或如权利要求4所述的载体，或如权利要求5所述的细胞在催化甾体化合物11α羟基化中的应用。7.如权利要求1中所述的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爱涛，彭雅琴，高成华，赵晶，张铮斌，李纯，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：