大麦HvNAT2基因及其用途制造技术

本发明专利技术公开了大麦HvNAT2基因及其在调控大麦对镉胁迫耐受性方面的应用，属于基因工程技术领域。大麦HvNAT2基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过对大麦HvNAT2基因的克隆和分析，并结合同源遗传转化过表达和RNAi技术在大麦品种黄金希望上对该基因进行功能验证发现，HvNAT2过表达植株的耐镉性显著增强，而HvNAT2

【技术实现步骤摘要】
大麦HvNAT2基因及其用途


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及大麦HvNAT2基因及其在调控大麦对镉胁迫耐受性方面的应用。

技术介绍

[0002]土壤镉污染不仅影响作物的产量和品质，并可通过食物链危害人体健康，严重影响粮食安全。而工业化的发展导致土壤镉污染日渐严重，镉米、镉麦的存在已是不争事实，镉中毒事件亦有发生(Hu等，2016；Wang等，2019；沈凤斌，2017)。显然，土壤镉污染已对作物生产和农产品安全及人类健康构成了严重威胁，镉污染治理已经成为各界普遍关注的热点问题。提高作物对镉耐性和减少食用器官镉积累是持续高效利用土地资源和解决“饭碗里重金属”之殇的一项重要科学任务。
[0003]对于中、轻度大面积污染的农田，培育耐镉且食用器官低积累作物品种，是有效利用自然资源和保证农产品安全生产最经济和重要的途径之一。发掘耐镉与低镉积累种质与相关基因，明确其调控机制是培育耐镉且低镉积累品种的基础和关键。植物的耐镉性或对镉的适应能力是一个复杂的性状，涉及很多代谢途径和表型特征；同时，同一作物不同的基因型间可能拥有不同的镉响应模式，因此解析植物的耐镉机制仍然是一个具有挑战性的任务。
[0004]大麦是全球各地普遍栽培的第四大禾谷类作物，也是人类直接或间接摄取镉的主要来源之一(Hayes等，2020；Lei等，2020)，其产品安全与人类健康密切相关。同时，大麦是二倍体自花授粉作物，其染色体数目少，可作为其它麦类作物的模式植物，十分适合生理和遗传机理研究(Forster等，2000)。因此挖掘镉耐性相关基因，探究大麦镉耐性机制，培育耐镉
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低积累品种极为重要。
[0005]NATs(Nucleobase
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Ascorbate Transporters)转运蛋白广泛存在于生物体内，主要转运碱基以及抗坏血酸。在植物中有关NAT的具体生物学功能鲜有报道；NAT蛋白与植物抗逆途径的研究刚起步，孙婷婷(2018)研究发现，苹果中MdNAT1和MdNAT7参与了干旱和盐胁迫响应机制。在大麦中还未有关于NAT基因的研究，因此鉴定大麦NAT家族，探究其调控镉胁迫响应和功能，对提高大麦抵御非生物胁迫能力和大麦的遗传改良与育种具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种从大麦中克隆得到的具有耐镉胁迫特性的基因，为大麦耐镉胁迫育种与生产提供了理论依据和相关基因。
[0007]为实现上述目的，本专利技术从大麦(Hordeum vulgare L.)Zhenong8和W6nk2中鉴定克隆到具有耐镉胁迫特性的基因HvNAT2，ZN8和W6nk2分别为本课题组前期筛选得到的耐镉和镉敏感基因型。
[0008]HvNAT2基因克隆与分析：以镉耐性差异大麦基因型Zhenong8(ZN8；耐镉基因型)和
W6nk2(镉敏感基因型)为材料，5μM CdCl2镉胁迫试验，比较分析了大麦根系miRNA及其靶基因响应镉胁迫的基因型差异，鉴定到与ZN8耐镉性相关的候选miRNA(miR156g
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3p_3)及其靶基因HORVU3Hr1G073180.2。高通量测序和qRT
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PCR验证结果表明，镉胁迫下，保守miRNA miR156g
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3p_3在ZN8中上调表达，但在W6nk2中表达不变(Cd vs CK)；而其靶基因HORVU3Hr1G073180.2在ZN8中下调表达，在W6nk2中表达不变。miR156g
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3p_3和HORVU3Hr1G073180.2表达变化与miRNA调控靶基因的典型机制吻合。将靶基因HORVU3Hr1G073180.2的核酸序列翻译成蛋白序列，其在NCBI中注释为Nucleobase
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ascorbate transporter(NAT)，是以碱基类物质为底物的转运蛋白。基于隐马尔可夫模型和BLAST分析，在大麦基因组中共发现了9个NAT家族成员，分别位于大麦第2、3、4、5和6号染色体上，因此将位于3号染色体上的该基因命名为HvNAT2。HvNAT2的CDS全长为1575bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供了所述的大麦HvNAT2基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]HvNAT2蛋白由524个氨基酸残基组成，该蛋白分子量为57.15kDa，等电点pI＝8.13。含有保守的(Q/E/P)NXGXXXXT(R/K/G)和QH结构域。通过SMART和Protter网站的蛋白结构域预测显示，HvNAT蛋白含有1个Pfam结构域Xan_ur_permease，属于APC(Amino
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polyamine
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organocation)超家族，转运核酸类物质，预测有11个跨膜结构域(Transmembrane domains，TMDs)。蛋白三级结构预测表明具有嘌呤/H+同向转运结构。
[0011]利用oneKP植物转录组数据库分析表明，HvNAT2与小麦TaNAT2和山羊草AetNAT2的关系最近，其次是二穗短柄草的BdNAT2。HvNAT2和TaNAT2、OsNAT2、ZmNAT2蛋白序列比对结果，HvNAT2蛋白序列与TaNAT2蛋白序列有99.05％的相似度，与OsNAT2蛋白序列有95.61％的相似度，与ZmNAT2有91.48％的相似度。
[0012]HvNAT2基因的表达模式分析：通过荧光定量PCR技术分析，HvNAT2基因在叶片中的表达量高于茎和根系，而且在灌浆期的种子中表达量最高。进一步分析HvNAT2基因对镉胁迫时间的响应变化，耐镉品种ZN 8叶片中HvNAT2基因的相对表达量在10μM Cd胁迫1h后即达到最大值。
[0013]采用地高辛(DIG)为标记的原位PCR技术分析，HvNAT2主要在维管束中表达。HvNAT2的亚细胞定位分析显示，HvNAT2定位于细胞质膜上。
[0014]进一步地，利用农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化技术，获得了HvNAT2基因的过表达和RNAi沉默植株。通过水培镉胁迫试验，对遗传转化植株进行了表型鉴定。结果显示：
[0015]在无镉正常生长条件下，HvNAT2过表达植株、HvNAT2
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RNAi沉默植株的长势与野生型(GP)没有明显差异。在镉胁迫下，过表达植株的长势显著优于GP。生物量的测量结果表明，两者在正常生长条件下地上部和地下部干重无明显差异，但是镉胁迫下过表达植株的地上部和地下部下降幅度显著低于GP；过表达植株的分蘖数大于GP，且GP枯死的老叶显著多于过表达植株。而相反的，在镉胁迫下，HvNAT2
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RNAi植株长势显著低于野生型(GP)，生物量的测量结果表明，沉默植株的下降幅度显著高于GP。这些结果表明HvNAT2基因过表达后植株的耐镉性显著增强，而RNAi沉默后的使大麦对镉的耐受性显著降低。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大麦HvNAT2基因，其特征在于，该基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的大麦HvNAT2基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述的大麦HvNAT2基因在调控大麦对镉胁迫耐受性方面的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，大麦HvNAT2基因过表达使植株耐镉性增强；大麦HvNAT2基因沉默使植株对镉的耐受性降低。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬飞波，王年鸿，周雪怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：