本发明专利技术提供二色补血草基因LbWER及其应用。本发明专利技术从二色补血草中克隆获得基因LbWER的cDNA序列全长789bp，编码262个氨基酸。经过基因克隆、生信分析、载体构建、侵染转化、表型观察等实验，可以观察到对野生型二色补血草敲除LbWER基因后其盐腺发生了明显改变，在DIC观察下盐腺由野生型的四个发光点变为三个或两个发光点，说明盐腺组成细胞数目变少，即LbWER基因可能与盐腺的发育有关，野生型二色补血草缺失LbWER基因会导致盐腺畸形，说明LbWER基因调控了盐腺的发育过程。本发明专利技术为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础。示盐腺的发育机制奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
二色补血草基因LbWER及其应用
[0001]本专利技术涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因LbWER及其应用。
技术介绍
[0002]土壤盐碱化是一个全球性的环境问题，影响着地球表面6.5％左右的土地。在大约2.3亿公顷的灌溉农田中，有20％左右的土地面积受到盐渍化的影响，由于不适当的灌溉习惯，这一比例每年都在增加(Munns and Tester,2008；王宝山,2010)。要扩大耕地面积必须改造和充分利用大面积的盐碱地。极少有农作物可以在盐渍化严重的地区生存，这导致农产量大幅下降，还会导致土壤退化和荒漠化(Flowers&Colmer 2008)。因此，为了应对盐渍化对农业的挑战，有必要通过用耐盐基因转化非盐生植物来提高其耐盐性。盐生植物具有耐盐的关键特性，可以在≥200mM NaCl的环境中生存并完成其生命周期，并在生态保护和盐渍土壤的恢复中发挥重要作用。了解盐生植物的耐盐机理可能有助于我们探索抗盐基因，以增强作物等非盐生植物对高盐度环境的适应性(Cuin and Shabala 2007)，这不仅对于盐碱地的开发和利用有重要意义，对农业生产和环境的可持续发展也起着至关重要的作用。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提供二色补血草基因LbWER及其应用。
[0004]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供二色补血草基因LbWER，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
[0005](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0006](b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0007]本专利技术从二色补血草中克隆获得基因LbWER的cDNA序列全长789bp(SEQ ID NO:2)，编码262个氨基酸。经分析，LbWER属于R2R3
‑
MYB类转录因子。原位杂交结果将基因LbWER特异性定位到盐腺上，提示该基因可能与盐腺的发育有关。
[0008]第二方面，本专利技术提供二色补血草基因LbWER启动子，其序列为：
[0009]i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
[0010]ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或
[0011]iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0012]iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。
[0013]第三方面，本专利技术提供含有所述基因LbWER或所述启动子的生物材料，所述生物材
料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。
[0014]第四方面，本专利技术提供所述启动子在调控下游基因表达中的应用，所述下游基因包括但不限于基因LbWER，报告基因GUS、GFP等。
[0015]第五方面，本专利技术提供所述基因LbWER、所述启动子或含有所述基因LbWER或所述启动子的生物材料在制备转基因植物中的应用。
[0016]第六方面，本专利技术提供所述基因LbWER或含有基因LbWER的生物材料的以下任一应用：
[0017](1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；
[0018](2)用于植物品种改良和改良盐碱地。
[0019]优选地，所述植物为二色补血草。
[0020]所述调控为正调控，例如正调控盐腺细胞数目等。
[0021]第七方面，本专利技术提供一种使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常的方法，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因LbWER，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。
[0022]优选地，所述基因工程手段可选自诱变、定点突变、同源重组等中的一种。
[0023]进一步地，针对二色补血草中的目标基因LbWER设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化二色补血草，进而获得该基因功能缺失的转基因植株。
[0024]优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5
’‑
GGAAAAGAAAGCTACAAGA
‑3’
，5
’‑
TGGACTATGTGAACTGTCA
‑3’
。
[0025]第八方面，本专利技术提供一种促进植物盐腺发育(如盐腺细胞数目增加)的方法，所述方法选自如下
①
或
②
：
[0026]①
使植物表达所述基因LbWER编码的蛋白；
[0027]②
在植物中过表达所述基因LbWER。
[0028]优选地，所述植物为泌盐盐生植物，更优选二色补血草。
[0029]所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：
[0030]1)通过导入具有所述基因的质粒；
[0031]2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
[0032]3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
[0033]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
[0034]5)通过导入增强子。
[0035]第九方面，本专利技术提供按照上述方法获得的转基因植物的以下任一应用：
[0036]i.用于植物育种；
[0037]ii.用于盐碱地种植。
[0038]所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
[0039]本专利技术首次从二色补血草中克隆得到基因LbWER，经过基因克隆、生信分析、载体构建、侵染转化、表型观察等一系列实验，可以明显观察到对野生型二色补血草敲除LbWER基因后其盐腺发生了明显改变，在DIC观察下盐腺由原先的四个发光点变为三个或两个发
光点，说明盐腺数目变少，即LbWER基因可能与盐腺的发育有关，野生型二色补血草缺失LbWER基因会导致盐腺畸形。由于盐腺最主要的功能是将多余盐分排出体外，也说明LbWER基因可能参与到二色补血草的泌盐过程。本专利技术为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础。
附图说明
[0040]图1为本专利技术较佳实施例中LbWER蛋白二级结构分析结果。
[0041]图2为本专利技术较佳实施例中LbWER三级结构预测结果。
[0042]图3为本专利技术较佳实施例中LbWER基因进化树。
[0043]图4为本专利技术较佳实施例中LbWER在不同发育时期、二色补血草的不同部位以及不同盐处理时间下的表达量。盐处理时所用NaCl溶液浓度是300mM、6...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.二色补血草基因LbWER，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。2.二色补血草基因LbWER启动子，其特征在于，其序列为：i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。3.含有权利要求1所述基因LbWER或权利要求2所述启动子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。4.权利要求2所述启动子在调控下游基因表达中的应用，其特征在于，所述下游基因包括权利要求1所述基因LbWER，报告基因GUS、GFP。5.权利要求1所述基因LbWER、权利要求2...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁芳，徐晓静，王宝山，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：
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