含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及含AT结合序列和连续2

【技术实现步骤摘要】
含AT结合序列和连续2
‑
O
‑
葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及含AT结合序列和连续2
‑
O
‑
葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用，属于生物医药


技术介绍

[0002]肝素是一种古老的天然多糖类抗凝剂，属于高度硫酸化的糖胺聚糖家族，由α
‑
L
‑
艾杜糖醛酸(IdoA，≥80％)或β
‑
D
‑
葡糖醛酸与α
‑
D
‑
葡糖胺(GlcN)以1,4
‑
糖苷键连接的双糖单元交替聚合而成，其中IdoA残基通常为2
‑
O
‑
硫酸化(IdoA2S，≥85％)，而GlcA则极少发生2
‑
O
‑
硫酸化GlcA(GlcA2S，<5％)；GlcN残基超过80％发生N
‑
硫酸化(GlcNS)，少量为N
‑
乙酰化(GlcNAc)或N
‑
非取代(GlcNH
3+
)，并普遍发生6
‑
O
‑
硫酸化(GlcNS6S、GlcNAc6S)和(或)少量3
‑
O
‑
硫酸化(GlcNS6S3S)，从而使其结构呈高度不均一。
[0003]肝素应用于临床已经超过80年，至今仍广泛用于体外循环(如肾透析)和外科手术中的抗凝、血栓栓塞性疾病的治疗和预防等，全球市场规模近百亿美元且需求持续增长。当前，市售肝素产品主要包括从猪肠或牛肺中直接分离得到的未分级肝素(UFH，重均分子量～14kDa)和化学或酶法部分解聚得到的不同低分子量肝素(LMWHs，重均分子量3.5kDa～6kDa)，然而疯牛病、非洲猪瘟造成肝素原料的供应链极其脆弱，2008年的发生的“肝素污染事件”更引发了人们对动物源肝素可靠性和安全性的担忧。
[0004]化学法合成的肝素戊糖——磺达肝癸钠(商品名分子量1728Da)于2001年成功上市，证实采用合成技术制备结构确定的肝素分子有望作为更加安全有效的抗凝血药物替代现有动物源多组分肝素产品。2011年Jian Liu教授课题组模拟体内生物合成途径建立的化学酶法路线，具有合成步骤少、产率的优点，被公认是一种比化学法合成更具成本效益的制备合成肝素的新策略(Science,2011，334:498
–
501)。
[0005]大量研究证实，天然肝素的抗凝活性主要依赖肝素链中约占30％的独特戊糖序列(GlcNAc/NS6S
‑
GlcA
‑
GlcNS6S3S
‑
IdoA2S
‑
GlcNS6S)，该序列能够特异性地与抗凝血酶(AT)相互作用而表现出强效Xa因子抑制活性；同时，AT结合戊糖序列与位于其非还原端的、以三硫酸双糖(IdoA2S
‑
GlcNS6S)重复单元为主的片段共同形成的长链(≥18糖)，能够与AT、IIa形成三元复合物灭活IIa因子。此外，不同链长和修饰模式的肝素片段通过与不同靶蛋白相互作用，可赋予肝素不同的特性，这对设计不同的肝素类药物具有重要的指导意义。例如，未分级肝素UFH具有的一个突出的优点是其抗凝血活性可被鱼精蛋白完全中和，可在抗凝治疗结束或出现出血等不良反应时将其快速除去；相比之下，低分子肝素LMWHs只能被鱼精蛋白部分中和，而戊糖磺达肝癸钠则完全不能被中和，事实证实鱼精蛋白逆转肝素抗凝血的能力取决于AT戊糖序列之外的糖链长度及修饰模式。Jian Liu教授采用化学酶法高效制备了含AT结合戊糖序列与额外3个连续的IdoA2S
‑
GlcNS6S双糖的肝素十二糖，证实其具有特异抑制Xa因子的抗凝血抗血栓作用；该化合物还具有与未分级肝素UFH类似的、可被鱼精蛋白中和的抗凝活性，证实是由额外的IdoA2S
‑
GlcNS6S双糖重复序列赋予的(US9951149；
Nat Chem Biol,2014,10:248
‑
50；Sci Transl Med,2017,9(406))。然而，由于IdoA独特的弹性构象，富含IdoA2S
‑
GlcNS6S的聚阴离子糖链容易与不同的蛋白质产生特异或非特异性结合，可能会导致化合物皮下注射药代动力学不佳、肝素治疗相关的潜在副作用(如血小板减少症、非特异性出血)等。
[0006]根据文献报道(US9951149；J Biol Chem,2014,289:13407
‑
18)，肝素2
‑
O
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硫酸基转移酶(2OST)能够识别糖链特定的IdoA或GlcA残基并进行2
‑
O
‑
硫酸化修饰，目前基于酶的底物特异性已经能够高效制备含多个2
‑
O
‑
硫酸化IdoA(IdoA2S)残基的肝素分子；然而，2OST酶对GlcA残基的催化修饰效率大大低于IdoA残基，故利用现有化学酶法策略高效制备含不同数量、连续GlcA2S残基的肝素分子是不现实的。而关于不含连续IdoA2S残基的“稀有”肝素序列能否表现出可被鱼精蛋白逆转的抗凝血活性，目前尚未见报道。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供含AT结合序列和连续2
‑
O
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葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用。
[0008]本专利技术第一个目的是提供一种含不同数量GlcA2S残基的稀有肝素分子。
[0009]第二个目的是提供采用化学酶法高效制备含不同数量且连续GlcA2S残基的稀有肝素分子的方法。
[0010]第三个目的是提供含AT结合序列和连续2
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O
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葡糖醛酸残基的肝素分子。
[0011]第四个目的是提供含AT结合序列和连续2
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O
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葡糖醛酸残基的肝素分子的制备方法。
[0012]第五个目的是提供含AT结合序列和连续2
‑
O
‑
葡糖醛酸残基的肝素分子的应用，具有强效Xa抑制活性且可被鱼精蛋白中和，用于制备更加安全、强效的抗凝血抗血栓药物。
[0013]术语说明：
[0014]AT：抗凝血酶
[0015]GlcA
‑
PNP：对硝基苯基
‑
β
‑
D
‑
葡糖醛酸苷
[0016]UDP
‑
GlcNTFA：尿苷二磷酸
‑
N
‑
三氟乙酰葡糖胺
[0017]UDP
‑
GlcNAc：尿苷二磷酸
‑
N
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含不同数量连续GlcA2S残基的稀有肝素分子，结构式如下式Ⅰ所示：其中，n为大于等于1的整数。2.权利要求1所述的含不同数量连续GlcA2S残基的稀有肝素分子的制备方法，采用化学酶法进行，包括步骤如下：(1)对硝基苯基
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β
‑
D
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葡糖醛酸苷(GlcA
‑
PNP)于缓冲液中与N
‑
乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)、糖基供体尿苷二磷酸(UDP)
‑
N
‑
三氟乙酰葡糖胺(UDP
‑
GlcNTFA)混合进行糖链延长反应，得到二糖骨架，二糖骨架于缓冲液中与Heparosan合酶2(PmHS2)、糖基供体UDP
‑
葡糖醛酸(UDP
‑
GlcA)混合进行糖链延长反应，得三糖骨架，三糖骨架与KfiA、PmHS2酶促糖链延长反应得到五糖骨架，重复上述酶促延长反应，直至得到七糖骨架；(2)将五糖骨架或七糖骨架溶于LiOH溶液中，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，调节pH至中性，然后于缓冲液中与肝素N
‑
硫酸基转移酶(NST)、硫酸基供体3'
‑
磷酸腺苷
‑
5'
‑
磷酸硫酸(PAPS)混合，以使糖链中的N
‑
非取代葡糖胺(GlcNH
3+
)残基发生N
‑
硫酸化(GlcNS)，得到N
‑
硫酸化五糖或N
‑
硫酸化七糖；(3)步骤(2)得到的N
‑
硫酸化五糖或N
‑
硫酸化七糖置于缓冲液中，与2OST酶、硫酸基供体PAPS混合反应，使偏好序列GlcA
‑
(GlcNS
‑
GlcA)2‑
或GlcA
‑
(GlcNS
‑
GlcA)3‑
中特定的GlcA残基转化为GlcA2S残基，得到含两个GlcA2S残基的稀有肝素五糖或三个GlcA2S残基的稀有肝素七糖；(4)以步骤(3)的稀有肝素五糖为起始原料，按照步骤(1)依次进行KfiA、PmHS2酶促糖链延长得到含一个GlcNTFA残基的七糖中间体，继续重复进行糖链延长得含两个GlcNTFA残基的九糖中间体；或直接以步骤(3)的稀有肝素七糖为起始原料，酶法延长糖链得含一个GlcNTFA残基的九糖中间体；(5)按照步骤(2)的方法使步骤(4)七糖中间体或两种九糖中间体的GlcNTFA残基脱除三氟乙酰基并转化为GlcNS，分别得非还原端含GlcA
‑
GlcNS
‑
GlcA
‑
的七糖中间体或含GlcA
‑
(GlcNS
‑
GlcA)
1～2
‑
的九糖中间体；(6)步骤(5)得到的七糖中间体或九糖中间体在2OST酶的催化下，以PAPS为硫酸基供体，非还原末端新引入的偏好序列GlcA
‑
(GlcNS
‑
GlcA)
1～2
‑
的特定GlcA残基转化为GlcA2S，得到与步骤(3)相同的、含3个GlcA2S残基的稀有肝素七糖或含4个GlcA2S残基的稀有肝素九糖。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(4)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达，糖链延长反应所用缓冲液为50mmol/L Tris
‑
HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，各反应液均以C18柱层析纯化；N
‑
乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(5)中，所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L；NST为哺乳动物细胞来源肝素N
‑
脱乙酰基酶/N
‑
硫酸基转移酶(NSDT)的N
‑
硫酸基转移酶活性片段的重组表达产物；NST酶促反应的缓冲液为50mmol/L的2
‑
(N
‑
吗啉代)乙烷磺酸(MES)，pH＝7.0
‑
7.4，硫酸基供体PAPS的加入量为被修饰GlcNH
3+
残基摩尔质量的1.1倍
‑
5倍，反应液以强阴离子交换柱层析纯化。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述2OST为哺乳动物细胞来源的并利用重组表达技术制备的重组酶，表达载体为大肠杆菌、酵母或者昆虫细胞；2OST酶促反应的缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES，pH7.0～7.4，硫酸基供体PAPS的加入量为被修饰GlcA残基摩尔质量的1.1倍
‑
5倍，反应液经强阴离子交换柱层析纯化得含2个GlcA2S残基的肝素五糖或3个GlcA2S残基的七糖；步骤(4)所述KfiA、PmHS2酶及延长反应条件与步骤(1)相同，但反应液以强阴离子交...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘纯慧，马亚卿，张桂姣，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：