一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用。所述类外泌体包括蛋白质外壳、特异性标志物以及核酸，所述核酸被包裹在蛋白质外壳内部，所述特异性标志物位于蛋白质外壳的表面，所述蛋白质外壳的直径范围在20~200 nm之间。该类外泌体具有与外泌体类似的特征：相似的结构、相似的大小、相似的表面特异性抗原、可以用与提取外泌体相同的方法提取类外泌体。本发明专利技术通过人工合成的方法制备一种类外泌体，可以作为外泌体的参考品、标准品，可以工业化大规模生产，且不需要额外的分离富集过程，解决了工业化制备外泌体参考品的制备和分离富集难题；此外，这种类外泌体相对于天然的外泌体更稳定，可以在更高的温度下保存，可以解决外泌体运输和保存的问题。解决外泌体运输和保存的问题。解决外泌体运输和保存的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用。

技术介绍

[0002]外泌体是大多数细胞都会分泌的一种囊泡结构，其大小在30~150 nm之间。由于外泌体携带了细胞中很多物质，包括蛋白质、核酸、脂质等，因此外泌体被认为在细胞通讯中起着关键作用。此外，越来越多的研究表明外泌体在诊断、治疗、载药以及疾病的预后等方面起着重要的作用。但是外泌体的制备和保存难题限制了其研发的进展、临床的应用以及商业化产品的开发。
[0003]首先是外泌体的制备方面：现在外泌体，特别是外泌体标准品的制备方式主要还是通过细胞培养或者从一些生物样本中收集和富集。但是通过细胞培养获得外泌体的周期很长，需要专业人员操作，且需要避免细胞的染菌，对洁净度有很高的要求；此外大规模细胞培养成本也很高昂，一方面需要专业的设备如CellSTACK
®
、Wave Bioreactor
™
、Quantum
®
等，这些设备价格昂贵；另一方面培养细胞需要消耗大量的胎牛血清，这也会造成很大的试剂成本。也可以通过生物样本收集和富集外泌体，但是，由于生物样本的个体差异，无法保证每次收集的样本的性状一致，也就无法保证通过这些样本制备的外泌体每批的性状保持一致；此外，通过生物样本收集和富集的外泌体还会造成伦理问题，在一些国家，比如我们国家是禁止公司或个人收集人的血清、血浆用于实验或者生产需求。因此，不管是科研领域还是工业领域都希望可以开发出一种新的可以规模生产外泌体的技术。
[0004]其次是外泌体的富集方面：目前分离和富集外泌体的方法有很多，比如超高速离心法、沉淀法、色谱法、免疫亲和磁珠法、微流控技术、超滤法等。沉淀法富集的外泌体中含有大量的杂质（可能90%以上为杂质），这种纯度无法满足外泌体标准品的纯度；色谱法处理富集外泌体的速度相对较慢，且外泌体的浓度太低，无法有效浓缩，且色谱柱的耗材费成本高昂，限制了色谱法在外泌体工业化生产方面的大规模运用；免疫亲和磁珠法需要消耗大量的特异性抗体，因此成本非常高昂，无法在工业上应用；微流控技术是操控微小流体的一种技术，因此也无法实现工业级的外泌体分离；超高速离心和超滤法可以用于大规模外泌体的生产，但是超高速离心法设备昂贵，需要较长的离心时间，因为离心速度要提升到100000 g以上（1万倍地球重力），因此样本处理能力有限，且可能带来安全隐患；超滤法可以用于外泌体的浓缩，但是浓缩液中含有大量的大分子量的杂质，一般和其他外泌体分离富集方法配合使用。因此，不管是科研领域还是工业领域都希望可以开发出一种新的不需要额外分离和富集外泌体的技术。
[0005]最后是外泌体的保存和运输方面，由于外泌体是由很薄的磷脂双分子层包裹的囊泡结构，因此外泌体是很不稳定的，容易发生破裂，必须保存在
‑
80℃的条件下。有些公司会通过冻干的方式，将外泌体冷冻干燥，从而实现外泌体在4℃的保存。但是冻干存在以下问题：1. 需要摸索适合的赋形剂；2. 需要摸索适宜的冻干条件；3. 冻干的外泌体复溶后仍
然需要在
‑
80℃保存，即冻干解决了外泌体的运输问题，但是解决不了外泌体复溶后的保存问题；4. 外泌体冻干后性状改变的问题；5. 赋形剂可能对后期检测造成干扰；6. 冻干的外泌体复溶后多次使用反复冻融的问题，反复冻融会导致外泌体破裂。因此，不管是科研领域还是工业领域都希望可以开发出一种新的更稳定的外泌体标准品，以解决外泌体的保存和运输问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是，提供一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用。旨在解决工业化制备、分离和保存外泌体参考品、标准品较为困难的技术问题。
[0007]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种类外泌体，包括蛋白质外壳、特异性标志物以及核酸，所述核酸被包裹在白质外壳内部，所述特异性标志物位于蛋白质外壳的表面，所述蛋白质外壳的直径范围在20~200 nm之间。
[0008]作为优选实施方案，所述蛋白质外壳用于保护内部的核酸，避免核酸被降解。所述蛋白质外壳可以是人工合成的，也可以是市售购买获得的。所述蛋白质外壳具有和外泌体相似的直径，直径范围在20~200 nm之间。
[0009]作为优选实施方案，所述蛋白质外壳为病毒蛋白质外壳。
[0010]作为优选实施方案，所述病毒为假病毒，优选为装甲病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、噬菌体。
[0011]作为优选实施方案，所述核酸为用于检测外泌体是否存在或对外泌体进行定量的内参核酸。所述内参核酸为DNA或者RNA或者同时包含DNA和RNA。
[0012]作为优选实施方案，所述特异性标志物为外泌体表面含有的抗原。
[0013]作为优选实施方案，所述外泌体表面含有的抗原包括CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM
‑
1、SNAP、MHC I/II、HLA
‑
G、Integrins、Claudins、Tim4中的一种或多种抗原；优选为CD9、CD63、CD81中的一种或多种抗原。
[0014]作为优选实施方案，所述类外泌体还包括：标识类外泌体存在的定制位点。所述标识类外泌体存在的定制位点是指在蛋白质外壳表面修饰荧光基团、量子点、金、银或者其他能通过仪器检测、分辨出的标志物。
[0015]作为优选实施方案，所述特异性标志物基于化学键的交联反应和/或基于生物活性的交联反应连接在蛋白质外壳的表面。
[0016]作为优选实施方案，所述化学键的交联反应包括蛋白质表面氨基和醛基的反应或氨基与羧基的反应、蛋白质表面未被取代的芳基叠氮化物与氨基的反应、蛋白质表面碳化二亚胺与羧基或氢氧基的反应、蛋白质表面酰肼与醛基、酮基、羧基的反应、蛋白质表面亚氨酸酯与氨基的反应、蛋白质表面碘乙酰基与硫氢基的反应、蛋白质表面异氰酸酯与氢氧基、氨基的反应、蛋白质表面马来酰亚胺与硫氢基的反应、蛋白质表面琥珀酰亚胺与氨基的反应、蛋白质表面吡啶基二硫化物与硫氢基的反应、蛋白质表面乙烯基砜与硫氢基的反应中的一种或多种。
[0017]作为优选实施方案，所述生物活性的交联反应包括生物素
‑
亲和素反应、免疫亲和
反应、免疫沉淀、适配体结合反应中的一种或多种。
[0018]本专利技术还提供所述的类外泌体应用于外泌体提取的参考品和/或标准品。所述类外泌体的作用是模拟外泌体、作为外泌体的参考品和/或标准品。模拟外泌体指的是类外泌体具有与外泌体相似的性状以及可以用提取外泌体的手段提取到类外泌体。类外泌体具有与外泌体相似的性状包括：具有与外泌体相似的大小（直径20
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200 nm）；具有外泌体相似的结构：核酸被包裹在结构内部，使得核酸免受核酸酶的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类外泌体，其特征在于：包括蛋白质外壳、特异性标志物以及核酸，所述核酸被包裹在白质外壳内部，所述特异性标志物位于蛋白质外壳的表面，所述蛋白质外壳的直径范围在20~200 nm之间。2.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述蛋白质外壳用于保护内部的核酸，避免核酸被降解。3.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述蛋白质外壳为病毒蛋白质外壳。4.如权利要求3所述的一种类外泌体，其特征在于：所述病毒为假病毒，优选为装甲病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、噬菌体。5.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述核酸为用于检测外泌体是否存在或对外泌体进行定量的内参核酸。6.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述特异性标志物为外泌体表面含有的抗原。7.如权利要求6所述的一种类外泌体，其特征在于：所述抗原为CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM
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1、SNAP、MHC I/II、HLA
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G、Integrins、Claudins、Tim4中的一种或多种；优选为CD9、CD63、CD81中的一种或多种。8.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛滔，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：