一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法技术

本发明专利技术提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法。所述引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种。本发明专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法，该引物组能够精准、快速地检测水稻干尖线虫，且具有较高的灵敏度和特异性。该方法可以高效检测到最低浓度为1copy/μL的样品，而且可以通过增加反应时间，来提高荧光值，从而提高检测结果的准确性，能够在早期实现水稻干尖线虫量的检测，从而预防水稻干尖病。从而预防水稻干尖病。从而预防水稻干尖病。

【技术实现步骤摘要】
一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及病原检测领域，更具体地，涉及检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie，1942)属于滑刃线虫属，水稻干尖线虫为细长的蠕虫形，半透明，长度大约在620～880μm之间。水稻干尖线虫主要寄生在植物的地上部分，会危害植物的生长发育。水稻是水稻干尖线虫的最主要寄主，发病时水稻会出现“干尖”病或“白尖”病，并降低水稻的产量，严重时会使水稻减产50％以上。中国是世界上最大的稻米生产国，水稻干尖线虫广泛分布于我国大陆，并且近十多年来，该病害的危害也越来越严重，目前已经遍布于我国的各个主要稻作区。水稻干尖线虫潜伏在谷粒的颖壳和米粒间越冬，因而带虫的种子是本病主要初侵染源，一旦水稻干尖线虫病发生，就很难有好的手段记性彻底防控。所以，通过早期检测选用无病种子是简单易行且快速有效的预防措施。
[0003]目前，已经开发出的水稻干尖线虫的检测方法，包括荧光定量PCR和普通PCR等。目前，荧光定量PCR是检测水稻干尖线虫较为有效的方法，但是，对于核酸含量极低即Ct值在30
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40的样品，无法百分百确定样品阴阳性。对于水稻干尖线虫量极少的水稻种子是无法实现早期检测的。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法，能够在早期实现水稻干尖线虫量的检测，从而预防水稻干尖病。
[0005]一方面，本专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组，所述引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种，所述第一crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述第二crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第三crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第四crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述第六crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述第七crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述第八crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。
[0006]具体地，所述引物组还包括：第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述第一下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。
[0007]具体地，所述引物组还包括：报告基团，所述报告基团的序列如序列表中SEQ ID NO：11所示。
[0008]另一方面，本专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的体系，所述体系包括上述引物组。
[0009]又一方面，本专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
[0010]再一方面，本专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的方法，所述方法包括采用上述引物组进行检测。
[0011]具体地，所述方法还包括：采用RPA扩增水稻干尖线虫DNA，得到RPA扩增产物；
[0012]将所述RPA扩增产物采用上述引物组进行检测。
[0013]本专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组、体系、试剂盒及其方法，该引物组能够精准、快速地检测水稻干尖线虫，且具有较高的灵敏度和特异性。本专利技术实施例采用的引物组的序列较短，一般情况下第一上游引物和第一下游引物的长度分别为35个碱基左右，在保证扩增效果的基础上，本专利技术实施例提供的第一上游引物和第一下游引物的序列长度均控制在30～31个碱基，从而降低第一上游引物和第一下游引物的合成成本。同时，该检测方法对于水稻干尖线虫含量极低的弱阳性及疑似阳性样品的高效检测，该方法可以高效检测到最低浓度为1copy/μL的样品，而且可以通过增加反应时间，来提高荧光值，从而提高检测结果的准确性，这使得该方法能够在早期实现水稻干尖线虫量的检测，从而预防水稻干尖病。而且，本专利技术实施例提供的方法不需要昂贵的仪器设备，大大降低了检测成本。进行检测时只需要水浴锅或恒温培养箱及荧光检测仪，可节省荧光定量PCR仪器的昂贵费用。
[0014]本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0015]附图用来提供对本专利技术技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本专利技术的技术方案，并不构成对本专利技术技术方案的限制。
[0016]图1是本专利技术实施例一提供的琼脂糖凝胶电泳图。
[0017]图2是本专利技术实施例一提供的Tecan Infinite 200Pro荧光酶标仪测量的CRISPR/Cas12a检测20min的荧光值图。
[0018]图3是8个crRNA对标准质粒样品CRISPR/Cas12a检测0
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60min的荧光值图。
[0019]图4是本专利技术实施例一提供的CRISPR/Cas12a检测20min的检测浓度图。
[0020]图5是本专利技术实施例一提供的荧光定量PCR的检测浓度的Ct值图。
[0021]图6是本专利技术实施例一提供的荧光定量PCR的扩增曲线图。
[0022]图7是本专利技术实施例二提供的Tecan Infinite 200Pro荧光酶标仪测量的CRISPR/Cas12a检测0
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60min的不同样品浓度的荧光值图。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例的附图，对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]一方面，本专利技术实施例提供了一种检测水稻干尖线虫的引物组，引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种，第一crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，第二crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，第三crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，第四crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，第六crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，第七crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，第八crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测水稻干尖线虫的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一crRNA、第二crRNA、第三crRNA、第四crRNA、第五crRNA、第六crRNA、第七crRNA和第八crRNA中的至少一种，所述第一crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述第二crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述第三crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第四crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述第五crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述第六crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述第七crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述第八crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括：第...

【专利技术属性】
技术研发人员：张安鹏，曹黎明，储黄伟，程灿，牛付安，周继华，孙滨，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：