分选酶标记的梭菌神经毒素制造技术

本发明专利技术涉及一种制备标记多肽的方法，所述方法包括：a.提供一种多肽，其包含：i.分选酶受体位点或分选酶供体位点；ii.非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体；iii.能够与靶细胞上的结合位点结合的靶向部分(TM)；和iv.易位结构域；b.孵育多肽与：分选酶；标记底物，所述标记底物分别包含分选酶供体位点或分选酶受体位点，以及缀合的可检测标记；其中分选酶催化：多肽的分选酶受体位点的氨基酸与标记底物的分选酶供体位点的氨基酸之间的缀合；或标记底物的分选酶受体位点的氨基酸与多肽的分选酶供体位点的氨基酸之间的缀合；从而标记多肽；和c.获得标记多肽。本发明专利技术还涉及用于标记的多肽、标记多肽、编码所述多肽的核酸以及使用和制造所述多肽的方法。用和制造所述多肽的方法。用和制造所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分选酶标记的梭菌神经毒素
[0001]本专利技术涉及标记的多肽及其制备和使用方法。
[0002]梭菌属(genus Clostridia)中的细菌产生高毒力和特定的蛋白质毒素，这种毒素毒害其被运送到的神经元和其他细胞。此类梭菌神经毒素的实例包括破伤风梭菌(C.Tetani，TeNT)和肉毒杆菌(C.botulinum，BoNT)血清型A
‑
G和X产生的神经毒素(参见WO 2018/009903 A2)，以及巴拉特梭菌(C.Baratii)和丁酸梭菌(C.Butyricum)产生的神经毒素。
[0003]在梭菌神经毒素中，已知有一些毒力最强的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对小鼠具有0.5至5ng/kg的中位致死剂量(LD
50
)值。破伤风毒素和肉毒杆菌毒素均通过抑制受影响的神经元的功能，特别是抑制神经递质的释放而起作用。肉毒杆菌毒素作用于神经肌接头并抑制周围神经系统的胆碱能传递，而破伤风毒素作用于中枢神经系统。
[0004]梭菌神经毒素在梭菌属中表达为单链多肽。每种梭菌神经毒素均具有一条催化轻链，该轻链与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备标记多肽的方法，所述方法包括：a.提供一种多肽，其包含：i.分选酶受体位点或分选酶供体位点；ii.非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体；iii.能够与靶细胞上的结合位点结合的靶向部分(TM)；和iv.易位结构域；b.孵育多肽与：分选酶；和分别包含分选酶供体位点或分选酶受体位点的标记底物，和缀合的可检测标记；其中分选酶催化：多肽的分选酶受体位点的氨基酸与标记底物的分选酶供体位点的氨基酸之间的缀合；或标记底物的分选酶受体位点的氨基酸与多肽的分选酶供体位点的氨基酸之间的缀合；从而标记多肽；和c.获得标记多肽。2.用于使用分选酶标记的多肽，所述多肽包含：i.分选酶受体或供体位点；ii.能够在靶细胞中切割胞吐融合器的蛋白质的非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体；iii.能够与靶细胞上的结合位点结合的靶向部分(TM)；和iv.能够将非细胞毒性蛋白酶从内体内穿过内体膜易位到靶细胞的胞质溶胶内的易位结构域；其中当所述多肽包含分选酶供体位点时，所述分选酶供体位点位于所述多肽的N
‑
端，并且其中当所述分选酶供体位点包含G
n
或A
n
时，n至少为2；和其中所述供体位点的N
‑
端残基是所述多肽的N
‑
端残基；或者其中所述多肽包含一个或多个位于所述分选酶供体位点和可切割位点N
‑
端的氨基酸残基，当所述可切割位点被切割时，暴露分选酶供体位点的N
‑
端。3.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的多肽，其中所述分选酶受体或供体位点位于所述TM的C
‑
端或其中所述分选酶受体或供体位点位于所述非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体的N
‑
端。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中：所述分选酶受体位点包含L(A/P/S)X(T/S/A/C)(G/A)、NPQTN、YPRTG、IPQTG、VPDTG或LPXTGS，其中X是任何氨基酸(或由其组成)，和/或其中所述分选酶供体位点包含G
n
或A
N
，其中n是至少1(或由其组成)。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中：所述分选酶受体位点包含L(A/P/S)X(T/S/A/C)G，其中X是任何氨基酸，NPQTN，YPRTG，IPQTG，VPDTG,或LPXTGS,其中X是任何氨基酸(或由其组成)，和/或其中所述分选酶供体位点包含G
n
，其中n是至少1(或由其组成)。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中所述分选酶是分选酶A(SrtA)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中所述多肽包含：至少两个分选酶受体位点；至少两个分选酶供体位点；或至少一个分选酶受体位点和至少一个分选酶供体位点。8.根据权利要求7所述的方法或多肽，其中所述至少两个位点不同，优选地其中所述至少两个位点具有不同的氨基酸序列。9.根据权利要求7或8所述的方法或多肽，其中：所述第一分选酶受体或供体位点位于所述TM的C
‑
端，第二分选酶受体或供体位点位于非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体的N
‑
端；或者，所述第一分选酶受体或供体位点位于非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体的N
‑
端，而所述第二分选酶受体或供体位点位于所述TM的C
‑
端。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4或40具有至少70％序列同一性的多肽序列。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4或40具有至少80％序列同一性的多肽序列。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4或40具有至少90％序列同一性的多肽序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法或多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO:2、4或40所示的多肽序列(优选由其组成)。14.一种标记多肽，所述多肽包括：i.与所述多肽缀合的可检测标记；ii.氨基酸序列，其包含L(A/P/S)X(T/S/A/C)G
n
，其中X是任何氨基酸且n为至少1，L(A/P/S)X(T/S/A/C)A
n
，其中X是任何氨基酸且n为至少1，NPQTN，YPRTG，IPQTG，VPDTG，LPXTGS,其中X是任何氨基酸，NPKTG，XPETG，LGATG，IPNTG，IPETG，NSKTA，NPQTG，NAKTN，NPQSS，LPXTX，其中X是任何氨基酸，NPX1TX2，其中X1是Lys或Gln且X2是Asn、Asp或Gly，X1PX2X3G,其中X1是Leu、Ile、Val或Met，X2是任何氨基酸且X3是Ser、Thr或Ala，LPEX1G，其中X1是Ala、Cys或Ser，LPXS，LAXT，MPXT，MPXTG，LAXS，NPXT，NPXTG，NAXT，NAXTG，NAXS，NAXSG，LPXP，LPXPG,其中X是任何氨基酸，LRXTG
n
或LPAXG
n
，其中X是任何氨基酸且n为至少1；iii.非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体；iv.能够与靶细胞上的结合位点结合的靶向部分(TM)；和v.易位结构域。15.根据权利要求14所述的标记多肽，其中氨基酸序列包含L(A/P/S)X(T/S/A/C)G
n
，L(A/P/S)X(T/S/A/C)A
n
，NPQTN，YPRTG，IPQTG，VPDTG，LPXTGS，NPKTG，XPETG，LGATG，IPNTG，IPETG，NSKTA，NPQTG，NAKTN，NPQSS，LPXTX，NPX1TX2，X1PX2X3G，LPEX1G，LPXS，LAXT，MPXT，MPXTG，LAXS，NPXT，NPXTG，NAXT，NAXTG，NAXS，NAXSG，LPXP，LPXPG，LRXTG
n
或LPAXG
n
，其中X是任何氨基酸且n为至少1，并且所述氨基酸序列位于TM的C
‑
端；或其中氨基酸序列包含L(A/P/S)X(T/S/A/C)G
n
，L(A/P/S)X(T/S/A/C)A
n
，NPQTN，YPRTG，IPQTG，VPDTG，LPXTGS，NPKTG，XPETG，LGATG，IPNTG，IPETG，NSKTA，NPQTG，NAKTN，NPQSS，LPXTX，NPX1TX2，X1PX2X3G，LPEX1G，LPXS，LAXT，MPXT，MPXTG，LAXS，NPXT，NPXTG，NAXT，NAXTG，NAXS，NAXSG，LPXP，LPXPG,其中X是任何氨基酸，LRXTG
n
或LPAXG
n
，其中X是任何氨基酸且n为至少1个，并且所述氨基酸序列位于
非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体的N
‑
端。16.根据权利要求14或15所述的标记多肽，其包含与所述多肽缀合的另外的可检测标记和另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列包含L(A/P/S)X(T/S/A/C)G
n
，其中X是任何氨基酸且n为至少1，L(A/P/S)X(T/S/A/C)A
n
，其中X为任何氨基酸且n为至少1，NPQTN，YPRTG，IPQTG，VPDTG，LPXTGS,其中X是任何氨基酸，NPKTG，XPETG，LGATG，IPNTG，IPETG，NSKTA，NPQTG，NAKTN，NPQSS，LPXTX，NPX1TX2，X1PX2X3G，LPEX1G，LPXS，LAXT，MPXT，MPXTG，LAXS，NPXT，NPXTG，NAXT，NAXTG，NAXS，NAXSG，LPXP，LPXPG，LRXTG
n
或LPAXG
n
。17.根据权利要求16所述的标记多肽，其中(第一)氨基酸序列不同于另外的(第二)氨基酸序列。18.根据权利要求16或17所述的标记多肽，其中：(第一)氨基酸序列位于TM的C
‑
端，另外的(第二)氨基酸序列位于非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体的N端；或者(第一)氨基酸序列位于非细胞毒性蛋白酶或其蛋白水解失活突变体的N
‑
端，另外的(第二)氨基酸序列位于TM的C
‑
端。19.根据权利要求14
‑
18中任一项所述的标记多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、26或40具有至少70％序列同一性的多肽序列。20.根据权利要求14
‑
19中任一项所述的标记多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、26或40具有至少80％序列同一性的多肽序列。21.根据权利要求14
‑
20中任一项所述的标记多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2、4、26或40具有至少90％序列同一性的多肽序列。22.根据权利要求14
‑
21中任一项所述的标记多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO:26所示的多肽序列(优选由其组成)。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法、多肽或标记多肽，其中所述非细胞毒性蛋白酶包含梭菌神经毒素L链。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法、多肽或标记多肽，其中所述易位结构域包含梭菌神经毒素易位结构域。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法、多肽或标记多肽，其中所述多肽缺少梭菌神经毒素的功能性H
C...

【专利技术属性】
技术研发人员：O，
申请(专利权)人：益普生生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：