一种大肠杆菌及其在高产制备D-脯氨酸中的应用制造技术

本申请从水环境中微生物种群筛选分离出能够代谢葡萄糖合成D

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌及其在高产制备D
‑
脯氨酸中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一株能够生产D
‑
脯氨酸的大肠杆菌，以及利用该菌种发酵生产D
‑
脯氨酸的方法及应用。

技术介绍

[0002]D
‑
脯氨酸是一种重要的非天然氨基酸，其结构式如下所示：D
‑
脯氨酸是多种生物活性化合物的前体，可以被用于合成血清淀粉样P成分消耗剂、抗肿瘤创新药吡咯替尼、偏头痛药物依来曲普坦等药物，还可以作为抗菌肽的基本结构单元。除此之外，由于其拥有良好的构象刚性，也经常作为非对称合成的有机催化剂来使用。例如可以使用D型脯氨酸来催化交叉羟醛缩合反应以得到不同构象的产物。
[0003]现行的D
‑
脯氨酸合成主要是通过化学法来实现，通过合成外消旋脯氨酸、酒石酸拆分等多步工艺进行制备，在工业生产上，化学法步骤繁琐，污染环境。因此，开发更为环保的D
‑
脯氨酸不对称合成方法具有重要的应用价值。
[0004]生物工作者对手性D
‑
脯氨酸合成的合成也做了一些尝试。以外消旋脯氨酸作为底物，使用具有手性选择性的假丝酵母（JP 95
‑
289275）或解木糖赖氨酸芽孢杆菌（CN111424060A）将L
‑
脯氨酸消除，从而获得剩余的D
‑
脯氨酸。然而此类动力学拆分的方法，D
‑
脯氨酸的理论收率最高仅为50%，造成大量浪费。
[0005]因此，需要进一步开发高效制备D
‑
脯氨酸的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种高产D
‑
脯氨酸的大肠杆菌及其发酵生产D
‑
脯氨酸的应用方法。
[0007]本专利技术首先提供大肠杆菌菌株（Escherichia coli）TIMDP1，该菌株已于2021年8月13日保藏于中国典型微生物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内)，保管编号为CCTCC NO：M 20211024。
[0008]本专利技术的大肠杆菌可用于生产D
‑
脯氨酸，因而本专利技术提供所述大肠杆菌在生产D
‑
脯氨酸中的应用。
[0009]本专利技术进一步提供一种使用所述的大肠杆菌TIMDP1制备D
‑
脯氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：通过发酵培养所述大肠杆菌TIMDP1，并从发酵液中获得D
‑
脯氨酸。
[0010]其中发酵培养基中以葡萄糖为碳源、以硫酸铵为氮源，更优选地，在发酵培养基中
的葡萄糖添加量为2%
‑
6%（w/v）；所述的硫酸铵的添加量为1%
‑
3%。
[0011]在优选实施方式中，所述液体发酵培养所用的培养基配方为：所述发酵培养的培养基的配方为：K2HPO
4 12
‑
16g，KH2PO
4 4
‑
8g，MgSO4·
7H2O 100
‑
300mg，(NH4) 2
SO
4 12
‑
28g，MnSO
4 1
‑
3 mg，Fe
2 (SO4)
3 20
‑
40 mg，ZnCl
2 3
‑
10 mg，CaCl
2 100
‑
200 mg，葡萄糖 20
‑
60 g，H2O 1L。更优选地，所述液体发酵培养所用的培养基配方为：K2HPO
4 14 g，KH2PO
4 6 g，MgSO4·
7H2O 200 mg，(NH4) 2
SO
4 20 g，MnSO
4 1 .7 mg，Fe
2 (SO4)
3 25 mg，ZnCl
2 7 mg , CaCl
2 140 mg，葡萄糖 25 g，H2O 1L。
[0012]在优选实施方式中，所述发酵培养是在培养温度为30
‑
37℃，转速为800
‑
1200 rpm的发酵罐中。更优选地，所述发酵培养是在培养温度为30℃，转速为1000 rpm。
[0013]本申请人从水环境中微生物种群筛选分离出能够代谢葡萄糖合成D
‑
脯氨酸的大肠杆菌并进行持续迭代选育而获得了一株可产少量D
‑
脯氨酸的大肠杆菌TIMDP，并进一步通过D
‑
脯氨酸合成能力增强的基因改造而工程菌株大肠杆菌TIMDP1。经过实验验证，改造后的大肠杆菌TIMDP1D
‑
脯氨酸合成能力得到大大增强，具有较大的应用价值。
具体实施方式
[0014]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0015]实施例1、构建高产D
‑
脯氨酸的大肠杆菌工程菌株本专利技术人通过收集水环境中微生物种群，通过常规分离培养120种大肠杆菌菌落，以色谱检测代谢物的方法，筛选分离出能够代谢葡萄糖合成D
‑
脯氨酸的大肠杆菌并进行持续迭代选育，获得了一株可产少量D
‑
脯氨酸的大肠杆菌TIMDP（具体实验数据见后续实施例，此处不重复提供产D
‑
脯氨酸的实验过程和实验结果）。
[0016]经过代谢流分析，D
‑
脯氨酸的生物合成途径应该为葡萄糖经糖酵解途径，进入三羧酸循环，进而生成谷氨酸后，继续发生代谢反应后产生的。因此，以大肠杆菌TIMDP为出发菌株，在对谷氨酸代谢途径进行强化后，改造后的菌株应该具备更强的D
‑
脯氨酸生成能力。具体是在yghX和trpR位置整合proBA(ptrc启动子)，菌株改造构建方法具体如下：(一) ptrc99
‑
proBA(ptrc启动子)的构建在网站UniProtKB (https://www. uniprot. org/)找到proB Genbank (BA77911.2)和proA Genbank (BAA77912.2)的序列 (proB 在proA上游，在其中间加一段linker,序列为: GGAGCAGGCTG) ，通过分子克隆操作，整合到通用质粒ptrc99 lac operator后面，得到完整自ptrc99
‑
proBA质粒，然后以此质粒为模板扩增得到消除Lac操纵子的组成型质粒ptrc99
‑
proBA,并以此质粒为模板扩增从启动子到终止子的序列。
[0017]所用引物信息如下：消除Lac操纵子的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产D
‑
脯氨酸的大肠杆菌菌株（Escherichia coli），其特征在于，已于2021年8月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保管编号为CCTCC NO：M 20211024。2.如权利要求1所述的大肠杆菌菌株在生产D
‑
脯氨酸中的应用。3.一种制备D
‑
脯氨酸的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的大肠杆菌菌株，以葡萄糖为碳源、以硫酸铵为氮源，发酵产生D
‑
脯氨酸，从发酵液中获得D
‑
脯氨酸。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在发酵培养基中的葡萄糖添加量为2%
‑
6%（w/v）；所述的硫酸铵的添加量为1%
‑
3%。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵的培养组成为：所述发酵培养的培养基的配方为：K2HPO
4 12~16g，KH2PO
4 4~8g，MgSO4·
7H2O 100~300mg，(NH4) 2
SO
4 12~28g，MnSO
4 1~3 mg，Fe
2 (SO4)
3 20~40 mg，ZnCl
2 3~10 mg，CaCl
2 100~200 mg，葡萄糖 20~60 g...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：天津工微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：