一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜两端分别设有样品垫和吸水垫，所述样品垫、吸水垫和硝酸纤维素膜均置于底板上，其特征在于，所述硝酸纤维素膜设有检测线和控制线，所述检测线含有恙虫病东方体混合重组抗原，所述质控线含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体。本发明专利技术采用双抗原夹心法实现对恙虫病东方体抗体的检测，具有检测仪器成本低，操作简单，快速，稳定性好，特异型好，灵敏度高，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。具有市场开发价值。具有市场开发价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于荧光免疫检测
，具体涉及一种双抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsμgamushi，Ot)所引起的自然疫源性疾病。恙螨幼虫是恙虫病惟一的传播媒介，恙螨幼虫通过叮咬鼠类等啮齿类动物形成自然界的感染循环。恙虫病东方体跟随恙螨的咬噬而进入人体，先在皮肤叮咬处开始繁衍，再进入血液，最初攻击的是破损部位的髓样细胞，进而攻击血管内皮细胞。之后恙虫病东方体利用宿主细胞上存在的表面蛋白聚糖和菌体表面蛋白将其自身附着到靶细胞上。恙虫病在我国分布极为广泛，受地理地貌、气候、野生动物影响很大，不同菌株和不同地区的恙虫病东方体抗原性和毒力又存在差异，恙虫病的致病机制也尚未完全明确，辅助检查无特异性，导致该病的预防和诊断仍面临较大困难。
[0003]目前，恙虫病的检测方法主要分为两大类，一是免疫学检测方法，二是针对病原体核酸的检测方法。免疫学方法主要包括间接免疫荧光法(IFA)、外斐氏反应、酶联免疫吸附法(ELISA)等。IFA方法具有一定的局限性：成本高昂、操作复杂、检测操作需要专业培训、试剂生产也需要相应的生物安全防护设施，因而IFA在疫区的应用有限。外斐氏反应凝集试验该方法的灵敏度和特异性都无法满足临床要求。ELISA的灵敏度较高，而且检测结果为具体数值，可以进行相对定量，制作成本低，可以进行高通量检测，但是ELISA依然存在着不少问题：操作步骤繁琐、容易出现污染、需要专业人员进行操作等。针对病原体核酸的检测方法，包括普通PCR，荧光定量PCR，环介等温扩增试验(LAMP法)，重组聚合酶反应(RAP法)等。整体来说，PCR技术诊断的准确性是优于其他方法对于早期恙虫病的诊断，但是也存在着一些急需改进的问题，如实时PCR针对56
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KDa抗原检测具有高速特异性但序列变异性可能改变引物的退火温度，从而降低实验的灵敏度。另外PCR法需要专门的仪器设备以及相应的基础设施，在体系配置阶段又容易产生污染，同时也需要专业人员进行操作。
[0004]免疫层析技术是一种将色谱层析技术、免疫学技术以及免疫标记技术相结合的固相膜免疫分析技术。通常是根据标记物的光学特性等获得可观察或测量的信号，最终判定检测结果。它的诊断原理是：样品溶液借助毛细作用在硝酸纤维(NC)膜上泳动，层析时标记物与待测物的复合物被相应的配体捕获而浓集显色，以NC膜上显色条带的有无或多少来定性或定量分析。
[0005]近年来，随着免疫层析技术的发展加上具有携带方便、操作简单且敏感性、特异性高等特点，胶体金免疫层析试纸条开始应用于恙虫病的诊断。目前，国外已报道有三个商品化的胶体金免疫层析试纸，澳大利亚Panbio公司产品，以Karp标准株重组蛋白为诊断抗原；美国的Access Bio公司产品，以Karp、Gilliam和Kato株混合重组抗原作为诊断抗原；美国InbBios公司产品，以Karp、Gilliam、Kato和TA716混合重组抗原作为诊断抗原。但胶体金试
纸条的T/C线最终为红色线条，在血清的检测过程中会受到血清背景颜色的干扰，影响实验的准确结果，且胶体金在日光下进行读取，灵敏度有一定的局限性。荧光微球是在受到激发光的激发后发出肉眼可见的荧光，抗干扰能力强，降低信噪比，具有更高的灵敏度。
[0006]荧光微球是指将荧光染料通过物理和化学等方法吸附或包埋到粒子内而形成的，直径在纳米至微米级(0.01
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10μm)范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。相比胶体金等传统标记物(须大量聚集才会被辨别出)，它的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限。在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性。形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。荧光微球免疫层析试纸条检测恙虫病东方体抗体目前未见其他报道。因此，基于荧光免疫层析技术和双抗原夹心免疫法，构建一种恙虫病东方体抗体的高效快检方法具有重要意义。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条和制备方法。
[0008]本专利技术还提供包括上述检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条的试纸卡或试剂盒。
[0009]本专利技术还提供了上述检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条的应用。
[0010]为了解决上述技术第一个技术问题，本专利技术公开了一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条，包括硝酸纤维素膜4，所述硝酸纤维素膜4两端分别设有样品垫2和吸水垫7，所述样品垫2、吸水垫7和硝酸纤维素膜4均置于底板3上，所述硝酸纤维素膜4设有检测线5和控制线6。
[0011]优选地，所述样品垫2设有加样孔。
[0012]其中，所述检测线5含有恙虫病东方体混合重组抗原；优选地，所述恙虫病东方体混合重组抗原喷涂在检测线5上。
[0013]其中，所述质控线6含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体；优选地，所述兔抗恙虫病东方体多克隆抗体喷涂在质控线6上。
[0014]其中，所述恙虫病东方体混合重组抗原是以从恙虫病东方体SJ2菌株感染的L929细胞培养液中提取的基因组为模板，扩增目的基因；将所得目的基因连接表达载体p ET
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28(+)，经转化、表达，所得SJ2重组抗原与Ptan株重组抗原和Gilliam重组抗原按照1：(0.5
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1.5)：(0.5
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1.5)体积比混合获得；优选地，所述SJ2重组抗原与Ptan株重组抗原和Gilliam重组抗原的用量比为1：1：1。
[0015]其中，所述扩增目的基因的上下引物和下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述Ptan株和Gilliam标准株重组抗为课题组前期制备。
[0016]其中，所述Ptan株重组抗原制备方法可参考文献”Min Cao,Hengbin Guo,Tang Tan g,et al.Preparation of Recombinant Antigen of Tsutsugamushi Ptan Strain and Develop ment of Rapid Diagnostic Reagent for Scrub Typhus[J].Am J Trop Med Hyg,2007,76(3)：553
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558”。
[0017]其中，所述Gilliam株重组抗原制备方法可参考文献”操敏,郭恒彬,郁兴明,王柏仁,杨文富,唐家琪.恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定[J].中国公共卫生,2004,{4}(07):5
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7.”[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条，包括硝酸纤维素膜(4)，所述硝酸纤维素膜(4)两端分别设有样品垫(2)和吸水垫(7)，所述样品垫(2)、吸水垫(7)和硝酸纤维素膜(4)均置于底板(3)上，其特征在于，所述硝酸纤维素膜(4)设有检测线(5)和控制线(6)，所述检测线(5)含有恙虫病东方体混合重组抗原，所述质控线(6)含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体。2.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述恙虫病东方体混合重组抗原是以从恙虫病东方体SJ2菌株感染的L929细胞培养液中提取的基因组为模板，扩增目的基因；将所得目的基因连接表达载体pET
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28(+)，经转化、表达，所得SJ2重组抗原与Ptan株重组抗原和Gilliam株重组抗原按照1：(0.5
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1.5)：(0.5
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1.5)体积比混合获得；其中，所述扩增目的基因的上下引物和下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，0.1
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0.5mg/mL的恙虫病东方体混合重组抗原被吸收在检测线中；0.3
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0.7mg/mL的兔抗恙虫病东方体多克隆抗体被吸收在质控线中。4.包含权利要求1
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3中任意一项所述试纸条的试纸卡或试剂盒。5.权利要求1
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3中任意一项所述试纸条，或权利要求4所述试纸卡，或权利要求4所述试剂盒在检测恙虫病东方体抗体中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，将样品稀释液、荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原和待检测血清混合后，置于样品垫上，静置，紫外灯下观察；当质控线和检测线...

【专利技术属性】
技术研发人员：操敏，燕书豪，熊晓辉，高豹，蔡旭燊，赵芷若，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：