一种测定甘胆酸的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种测定甘胆酸的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1以及试剂R2，其中试剂R1包括缓冲液50

【技术实现步骤摘要】
一种测定甘胆酸的试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及医学检验领域，具体涉及一种测定甘胆酸的试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]甘胆酸(CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，CG在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1％，在正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后，其血清CG浓度均稳定在低水平，当人体肝细胞受损或胆汁淤滞时，就会引起甘胆酸代谢和循环紊乱，甘胆酸值高低与干细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关，临床上一般用CG检测肝胆损伤疾病和妊娠期肝内胆汁淤积症。
[0003]目前已知的检测CG的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶标免疫分析法(ELISA)、胶乳免疫比浊分析法以及化学发光分析法。其中RIA以及ELASA方法操作繁琐，反应时间长，一般用于定性或半定量分析，因此不利于在临床上广泛应用；胶乳免疫比浊法具有灵敏度高，重复性好的特点，但胶乳颗粒具有较强的粘附性，容易污染比色杯并造成交叉污染；而化学发光法灵敏度较高，但需要配套昂贵的检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。
[0004]均相酶免疫技术是一种基于液相均相反应体系的竞争性免疫测定技术，因其具有反应灵敏度高、特异性强的特点。在甘胆酸均相法检测中，样本游离的甘胆酸与葡萄糖六磷酸脱氢酶
‑
甘胆酸偶联物竞争性结合抗甘胆酸特异性抗体位点，当样本中游离的甘胆酸越多，其竞争结合的抗体位点越多，抗体释放出的酶标偶联物就越多。游离出来的甘胆酸酶标偶联物催化β
‑<br/>烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD+)转化为β
‑
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)，在340nm波长处测定吸光度的上升与甘胆酸的含量成正比。通过与同样处理的甘胆酸校准品比较，即可计算出样品中CG的含量。而在该方法学中，葡萄糖六磷酸脱氢酶
‑
甘胆酸偶联物的标记效率会直接影响试剂的批间差异和稳定性。

技术实现思路

[0005]专利技术人意外发现，通过限定葡萄糖六磷酸脱氢酶
‑
甘胆酸偶联物的标记时间、限定标记终止液的添加量和加入时间以及通过超滤离心偶联物溶液的方式，可以有效控制标记效率和标记批间差异。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术手段：一种测定甘胆酸的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于：
[0007]所述试剂R1包括的成分及相应的含量为：缓冲液50
‑
200mM，酶激活剂10
‑
25mM，保护剂5.0
‑
30g/L，葡萄糖六磷酸盐2.0
‑
8.0g/L，表面活性剂0.5
‑
1.5g/L，甘胆酸
‑
葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联物1.0
‑
4.0ul/L；
[0008]所述试剂R2包括的成分及相应的含量为：缓冲液30
‑
200mM，保护剂5.0
‑
25g/L，NAD 0.5
‑
4.0g/L，NADH 0.01
‑
0.1g/L，抗甘胆酸抗体10
‑
30mg/L；
[0009]所述甘胆酸
‑
葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联物的制备过程中，甘胆酸与葡萄糖六磷酸
脱氢酶的标记时间为2
‑
4h，且标记结束后加入终止液终止反应。
[0010]优选地，所述终止液选自甘氨酸、酪蛋白或BSA中的至少一种，优选为甘氨酸。
[0011]优选地，所述试剂R1还包括：离子螯合剂5.0
‑
20mM，盐离子20
‑
100mM，防腐剂0.5
‑
1.5g/L；所述试剂R2还包括：盐离子10
‑
40g/L，防腐剂0.5
‑
1.5g/L。
[0012]优选地，在所述试剂R1中：
[0013]所述缓冲液选自咪唑、CHES、APMSO或Tris
‑
HCl中的至少一种；所述离子螯合剂选自EGTA或EDTA中的至少一种；所述酶激活剂选自氯化镁或氯化钙中的至少一种；所述盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述保护剂选自BSA或酪蛋白中的至少一种；所述表面活性剂选自TX
‑
100、Brj
‑
58、TX
‑
305或TX
‑
405中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin
‑
300中的至少一种；
[0014]在所述试剂R2中：
[0015]所述缓冲液选自MES、甘氨酸或HEPES中的至少一种；所述盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述保护剂选自BSA或酪蛋白中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin
‑
300中的至少一种。优选地，所述试剂R1的PH为7
‑
9，优选为8
‑
9；所述试剂R2的PH为5
‑
7，优选为6
‑
6.5。
[0016]一种测定甘胆酸试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0017](1)葡萄糖六磷酸脱氢酶溶液的制备
[0018]按照下述配方进行配制：
[0019]缓冲液50
‑
200mM，葡萄糖六磷酸脱氢酶20
‑
50KU，六水合氯化镁1.0
‑
10mM，盐离子100
‑
200mM，NADH 10
‑
30g/L，葡萄糖六磷酸盐5.0
‑
20g/L，二乙二醇乙醚10
‑
100ml/L，二甲亚砜20
‑
50ml/L；
[0020](2)甘胆酸的活化
[0021]按照下述配方进行配制：
[0022]甘胆酸5.0
‑
30g/L，N
‑
N二甲基甲酰胺0.5
‑
20ml，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐5.0
‑
20g/L，N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺5.0
‑
20g/L；
[0023]冰水浴搅拌条件下将甘胆酸用N
‑
N
‑
二甲基甲酰胺溶解，随后加入羧基活化剂(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)进行活化处理40
‑
50min；
[0024](3)甘胆酸
‑
葡萄糖六磷酸脱氢酶标记
[0025]将活化的甘胆酸溶液加入葡萄糖六磷酸脱氢酶溶液中，在冰水浴条件下反应，加入终止液，浓缩提纯；
[0026](4)试剂R1的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定甘胆酸的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于：所述试剂R1包括的成分及相应的含量为：缓冲液50
‑
200mM，酶激活剂10
‑
25mM，保护剂5.0
‑
30g/L，葡萄糖六磷酸盐2.0
‑
8.0g/L，表面活性剂0.5
‑
1.5g/L，甘胆酸
‑
葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联物1.0
‑
4.0ul/L；所述甘胆酸
‑
葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联物的制备过程中，甘胆酸与葡萄糖六磷酸脱氢酶的标记时间为2
‑
4h，且标记结束后加入终止液终止反应。2.根据权利要求1所述的一种测定甘胆酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2包括的成分及相应的含量为：缓冲液30
‑
200mM，保护剂5.0
‑
25g/L，NAD 0.5
‑
4.0g/L，NADH 0.01
‑
0.1g/L，抗甘胆酸抗体10
‑
30mg/L。3.根据权利要求2所述的一种测定甘胆酸的试剂盒，其特征在于，所述终止液选自甘氨酸、酪蛋白或BSA中的至少一种，优选为甘氨酸。4.根据权利要求3所述的一种测定甘胆酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1还包括：离子螯合剂5.0
‑
20mM，盐离子20
‑
100mM，防腐剂0.5
‑
1.5g/L；所述试剂R2还包括：盐离子10
‑
40g/L，防腐剂0.5
‑
1.5g/L。5.根据权利要求4所述的一种测定甘胆酸的试剂盒，其特征在于，在所述试剂R1中：所述缓冲液选自咪唑、CHES、APMSO或Tris
‑
HCl中的至少一种；所述离子螯合剂选自EGTA或EDTA中的至少一种；所述酶激活剂选自氯化镁或氯化钙中的至少一种；所述盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述保护剂选自BSA或酪蛋白中的至少一种；所述表面活性剂选自TX
‑
100、Brj
‑
58、TX
‑
305或TX
‑
405中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin
‑
300中的至少一种；在所述试剂R2中：所述缓冲液选自MES、甘氨酸或HEPES中的至少一种；所述盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述保护剂选自BSA或酪蛋白中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin
‑
300中的至少一种。6.一种如权利要求1
‑
5任一项所述的一种测定甘胆酸试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)葡萄糖六磷酸脱氢酶溶液的制备按照下述配方进行配制：缓冲液50
‑
200mM，葡萄糖六磷酸脱氢酶20
‑
50KU，六水合氯化镁1.0
‑
10mM，盐离子100
‑
200mM，NADH 10
‑
30g/L，葡萄糖六磷酸盐5.0
‑
20g/L，二乙二醇乙醚10
‑
100ml/L，二甲亚砜20
‑
50ml/L；所述缓冲液选自咪唑、CHES、APMSO或Tris
‑
HCl中的至少一种，所述盐离子选自氯化钠或氯化钙中的至少一种；(2)甘胆酸的活化按照下述配方进行配制：甘氨酸5.0
‑
30g/L，N
‑
N二甲基甲酰胺0.5
‑
20ml，1
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：李元丽，刘霖，杨焜诚，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：