一种基于EHDV核心样颗粒的阻断ELISA抗体检测试剂盒、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种基于鹿流行性出血热病毒(EHDV)核心样颗粒(CLPs)的阻断ELISA抗体检测试剂盒、制备方法及其应用。本发明专利技术所述试剂盒敏感性高、特异性好、操作便捷，结果判定采用阻断率(PI)法，准确度高，与进口试剂盒相比，检测符合率达99％以上。测符合率达99％以上。测符合率达99％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种基于EHDV核心样颗粒的阻断ELISA抗体检测试剂盒、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体地，涉及一种鹿流行性出血热病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]鹿流行性出血热(epizootic hemorrhagic disease virus，EHD)是由呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的鹿流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV)感染引起的鹿、山羊、牛等多种野生和家养反刍动物的虫媒性传染病。EHD主要分布在热带、亚热带和温带地区，但随着全球气候逐渐变暖，其传播媒介——雌性库蠓(Culicoides spp.)活动范围不断扩大，该病影响范围相应扩大逐渐呈全球分布的趋势。为此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病。EHD主要侵害鹿、山羊、牛等多种野生和家养反刍动物，其暴发给可给畜牧业带来严重的经济损失。我国近年来的血清学调查发现，云南、新疆、内蒙古、广西和广东等地均存在EHDV阳性畜群，其中特别需要注意是检出阳性样品中存在对牛有较强致病力的EHDV
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2，6和7型。2013～2017年期间，云南畜牧兽医科学院先后在我国云南、广西和广东等地分离到EHDV
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1、EHDV
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5、EHDV
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6、EHDV
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7与EHDV
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10等5种血清型；进一步的对我国15个省份的牛羊血清学调查结果显示，有13个省份的牛群中普遍存在EHDV抗体阳性动物，且阳性率呈现由北向南逐渐升高的趋势。这些研究表明EHDV在我国分布广泛，存在暴发并可能对我国反刍动物养殖业造成重大影响的风险，有必要开展EHD诊断试剂的研究开发。
[0003]目前EHDV血清学检测方法主要为血清中和试验、间接ELISA和竞争ELISA方法等方法。其中ELISA方法多数以全病毒或单个原核或真核表达的重组蛋白为包被抗原，前者存在扩散病毒的风险，后者不能完全展示抗原表位；而EHDV CLPs作为一种类似病毒的由EHDV VP3和VP7蛋白组装形成的空心颗粒，不含病毒核酸基因组，不具感染性，由于具有近似病毒结构和形态，可充分展示抗原表位。
[0004]有鉴于此，提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的是寻求一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测鹿流行性出血热病毒抗体的方法；
[0006]本专利技术的第二目的是寻求一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测鹿流行性出血热病毒抗体的阻断ELISA试剂盒。该试剂盒的优点之一是使用了EHDV CLPs作为包被抗原，提高了检测的敏感性和特异性。
[0007]基于上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]本专利技术首先提供一种EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，包括：
[0009]1)酶标板制备步骤：将EHDV CLPs包被到酶标板；
[0010]2)酶标抗体制备步骤：用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗EHDV VP7蛋白的群特异性单克隆抗体作为酶标抗体；
[0011]在一些实施方式中，所述步骤1)为将EHDV CLPs用0.1
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0.2M的Tris盐酸包被液稀释至1
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1.5μg/mL，4
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6℃包被12
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16h，洗涤后加入含1
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3％BSA的封闭液封闭；
[0012]在一些优选的实施方式中，将EHDV CLPs用0.2M pH8.0的Tris盐酸包被液稀释至1
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1.5μg/mL，4℃包被12
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16h，洗涤后加入含3％BSA的封闭液，37℃封闭，洗涤后保存。
[0013]在一些更优选的实施方式中，将所述EHDV CLPs用0.2M pH8.0的Tris盐酸包被液稀释至1.25μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被12h，洗涤后加入200μL含3％BSA的封闭液，37℃封闭2h，洗涤后保存。
[0014]在一些实施方式中，所述酶标抗体工作浓度稀释为1:6000
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1:8000，更优选的为1:6000。
[0015]在一些实施方式中，所述方法还包括：3)显色剂、终止液及阴阳性对照的组装步骤；优选的，所述显色剂和终止液为0.1mg/mL的四甲基联苯胺(TMD)显色液和2M硫酸溶液终止液；所述阳性对照和阴性对照分别为：所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的EHDV阳性的牛血清；所述阴性对照为无EHDV且无疫苗接种的健康牛血清。
[0016]本专利技术还提供一种EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒由上述方法制备。或，所述试剂盒包括酶标板和酶标抗体；其中，所述酶标板包被有EHDV CLPs，所述酶标抗体为用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗EHDV VP7蛋白的群特异性单克隆抗体。
[0017]在一些实施方式中，所述EHDV CLPs为EHDV VP3和VP7蛋白组装形成的空心颗粒；优选的，VP3和VP7蛋白序列如SEQ ID NO.1和2所示。
[0018]在一些实施方式中，所述酶标抗体工作浓度稀释为1:6000。
[0019]在一些优选的实施方式中，所述酶标板的制备方法包括：将所述EHDV CLPs用0.1
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0.2M的Tris盐酸包被液稀释至1
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1.5μg/mL，4
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6℃包被12
‑
16h，洗涤后1
‑
3％BSA的封闭液封闭
[0020]在一些更优选的实施方式中，所述酶标板的具体制备方法包括：将所述EHDV CLPs用0.2M pH8.0的Tris盐酸包被液稀释至1
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1.5μg/mL(优选为1.25μg/mL)，每孔加入100μL，4℃包被12
‑
16h，洗涤后加入200μL含3％BSA的封闭液，37℃封闭2
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4h，洗涤后保存。
[0021]在一些实施方式中，所述试剂盒还包括0.1mg/mL的四甲基联苯胺(TMD)显色液和2M硫酸溶液终止液；所示试剂盒还包括阳性对照和阴性对照：所述阳性对照血清为经商品化试剂盒确定的EHDV阳性的牛血清；所述阴性对照为无EHDV且无疫苗接种的健康牛血清。
[0022]本专利技术还提供一种上述EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒，或上述的EHDV CLPs在制备检测EHDV感染或疫苗接种的待测样品的产品中的应用。
[0023]在一些实施方式中，所述检测为：在每孔加入100μL以PBST稀释的待检血清，稀释比例为1:5
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1:10，37℃孵育60
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90min；PBST洗涤后加入1：6000稀释的HRP标记的抗EHDV VP7单克隆抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：步骤1)酶标板制备：将EHDV CLPs包被到酶标板，所述EHDV CLPs为EHDV VP3和VP7蛋白组装形成的空心颗粒；步骤2)酶标抗体制备：用辣根过氧化物酶HRP标记的抗EHDV VP7蛋白的群特异性单克隆抗体作为酶标抗体。2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)为：将EHDV CLPs用0.1
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0.2M的Tris盐酸包被液稀释至1
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1.5μg/mL，4
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6℃包被12
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16h，洗涤后加入含1
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3％BSA的封闭液封闭；所述步骤2)酶标抗体浓度稀释为1:6000
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1:8000；优选的，所述步骤1)具体为：将所述EHDV CLPs用0.2M pH8.0的Tris盐酸包被液稀释至1.25μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被12h，洗涤后加入200μL含3％BSA的封闭液，37℃封闭2h，洗涤后保存。3.一种EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由权利要求1
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2任一方法制备。4.一种EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括酶标板和酶标抗体；其中，所述酶标板包被有EHDV CLPs，所述EHDV CLPs为EHDV VP3和VP7蛋白组装形成的空心颗粒；所述酶标抗体为用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗EHDV VP7蛋白的群特异性单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板的制备方法包括：将所述EHDV CLPs用0.1
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0.2M的Tris盐酸包被液稀释至1
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1.5μg/mL，4
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6℃包被12
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16h，洗涤后1
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3％BSA的封闭液封闭；所述酶标抗体工作浓度稀释为1:6000
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1:8000；优选的所述酶标板的制备方法为：将所述EHDV CLPs用0.2M pH8.0的Tris盐酸包被液稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄超华，花群义，曹琛福，史卫军，吴江，林彦星，林永涛，翁巧玉，曾少灵，杨俊兴，
申请(专利权)人：深圳海关动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：