一种定性和定量测定蛋白质的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种定性和定量测定蛋白质的方法及应用，涉及蛋白质检测技术领域。本发明专利技术所述方法基于三元络合物体系检测蛋白质，将两个分别与待测溶液中不同表位特异性结合的没有相互作用的蛋白，依次与报告酶的不同片段组合成融合基因，并通过表达纯化后，获得两种融合蛋白，所述两个融合蛋白内包含的报告酶的蛋白片段在相互靠近时会发生重组，当加入报告酶底物时，会释放光信号，同时，被测蛋白的参考标准物质(或者参考材料)的发光程度与其浓度成正相关，且通过发光读数的检测数据即可高通量筛选出高表达的细胞株。量筛选出高表达的细胞株。量筛选出高表达的细胞株。

【技术实现步骤摘要】
一种定性和定量测定蛋白质的方法及应用


[0001]本专利技术属于蛋白质检测
，具体涉及一种定性和定量测定蛋白质的方法及应用。

技术介绍

[0002]目前常用的蛋白质检测方法，一般为采用放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附分析法(ELISA)，以定量定性分析样品中含有的蛋白质，但需要造价昂贵的检测设备，且操作过程复杂，因此不能随时随地的进行检测分析。
[0003]除了上述检测方法外，生化实验室中还常采用双缩脲法、BCA法、考马斯亮蓝法、Lowry法和紫外吸收法等生化检测方法来测定蛋白含量。但是上述方法还存在如下缺点：例如，考马斯亮蓝法对测试样品中的蛋白分子大小有更多限制；紫外吸收法基于蛋白中的芳香族氨基酸残基在280nm下的光吸收值进行检测，由于不同蛋白中的芳香族氨基酸的含量不同，该方法的检测准确性和专一性不好；同时，对于传统的双缩脲法、BCA法和Lowry法而言，并不适用于对含有溶解性差的醇溶蛋白和谷蛋白的谷物样品以及大部分动、植物工业衍生品中的蛋白含量进行检测。而且，待测样品体系中存在的淀粉、脂类以及纤维等成分也会影响上述实验室方法的检测准确度。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种定性和定量测定蛋白质的方法及应用，所述测定方法基于三元络合物体系检测蛋白质，是一种快速准确的蛋白质定性定量的测定方法，还能用于体外高通量筛选细胞株。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种定性和定量测定蛋白质的方法，包括以下步骤：(1)根据待测蛋白质种类，筛选分别与待测蛋白质的不同表位特异性结合的第一蛋白和第二蛋白，第一蛋白和第二蛋白间无相互作用；
[0007](2)将第一蛋白的编码基因与报告酶的一段基因片段融合后，表达纯化得第一融合蛋白；将第二蛋白的编码基因与报告酶的另一段基因片段融合后，表达纯化得第二融合蛋白；
[0008](3)将包含待测蛋白质的溶液与第一融合蛋白和第二融合蛋白混合孵育，将孵育产物和所述报告酶的底物混合后，检测光强度，从而检测所述溶液中所述待测蛋白质存在与否和所述待测蛋白质的含量。
[0009]优选的，当步骤(1)中所述待测蛋白质为免疫球蛋白G时，第一蛋白的种类包括Protein G或Protein L，第二蛋白的种类包括Protein L或Protein G。
[0010]优选的，步骤(2)所述报告酶包括荧光素酶NanoLuc@、分裂辣根过氧化物酶、分裂过氧化物酶APEX2或分裂荧光素酶。
[0011]优选的，所述荧光素酶NanoLuc@的一段基因片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO.1
所示的序列，另一段基因片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO.2所示的序列。
[0012]优选的，所述分裂辣根过氧化物酶的一段基因片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO.3所示的序列，另一段基因片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO.4所示的序列。
[0013]优选的，所述分裂过氧化物酶APEX2的一段基因片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO.5所示的序列，另一段基因片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO.6所示的序列。
[0014]优选的，所述分裂荧光素酶包括海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、发红光叩甲虫荧光素酶或发绿光叩甲虫荧光素酶。
[0015]优选的，步骤(3)所述包含待测蛋白质的溶液、第一融合蛋白和第二融合蛋白混合溶液、报告酶的底物的体积比为98:1:1。
[0016]本专利技术还提供了上述方法在体外筛选高表达细胞株中的应用。
[0017]本专利技术提供了一种定性和定量测定蛋白质的方法，所述方法基于三元络合物体系检测蛋白质，将两个分别与待测溶液中不同表位特异性结合的没有相互作用的蛋白，依次与报告酶的不同片段组合成融合基因，并通过表达纯化后，获得两种融合蛋白，所述两个融合蛋白内包含的报告酶的蛋白片段在相互靠近时会发生重组，当加入报告酶底物时，会释放光信号，同时，被测蛋白的参考标准物质(或者参考材料)的发光程度与其浓度成正相关，且通过发光读数的检测数据即可高通量筛选出高表达的细胞株。
附图说明
[0018]图1为本专利技术所述定性和定量测定蛋白质的方法的实验流程图；
[0019]图2为以荧光素酶NanoLuc@为基础定量蛋白质；
[0020]图3为分裂辣根过氧化物酶为基础定量蛋白质；
[0021]图4为分裂过氧化物酶APEX2为基础定量蛋白质。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种定性和定量测定蛋白质的方法，具体流程如图1所示，包括以下步骤：(1)根据待测蛋白质种类，筛选分别与待测蛋白质的不同表位特异性结合的第一蛋白和第二蛋白，第一蛋白和第二蛋白间无相互作用；
[0023](2)将第一蛋白的编码基因与报告酶的一段基因片段融合后，表达纯化得第一融合蛋白；将第二蛋白的编码基因与报告酶的另一段基因片段融合后，表达纯化得第二融合蛋白；
[0024](3)将包含待测蛋白质的溶液与第一融合蛋白和第二融合蛋白混合孵育，将孵育产物和所述报告酶的底物混合后，检测光强度，从而检测所述溶液中所述待测蛋白质存在与否和所述待测蛋白质的含量。
[0025]本专利技术根据待测蛋白质种类，筛选分别与待测蛋白质的不同表位特异性结合的第一蛋白和第二蛋白，第一蛋白和第二蛋白间无相互作用。当所述待测溶液中蛋白质为免疫球蛋白G时，第一蛋白的种类包括Protein G(SEQ ID NO.7)或Protein L(SEQ ID NO.8)，第二蛋白的种类包括Protein L或Protein G。本专利技术对所述Protein G和Protein L的来源并没有特殊限定，优选为本领域的常规市售产品。
[0026]本专利技术将第一蛋白的编码基因与报告酶的一段基因片段融合后，表达纯化得第一
融合蛋白；将第二蛋白的编码基因与报告酶的另一段基因片段融合后，表达纯化得第二融合蛋白。本专利技术所述报告酶优选包括荧光素酶NanoLuc@、分裂辣根过氧化物酶、分裂过氧化物酶APEX2或分裂荧光素酶，且所述荧光素酶NanoLuc@的一段基因片段(LgBit)的核苷酸序列优选包含SEQ ID NO.1所示的序列，另一段基因片段(SmBit)的核苷酸序列优选包含SEQ ID NO.2所示的序列；所述分裂辣根过氧化物酶的一段基因片段(HPR L)的核苷酸序列优选包含SEQ ID NO.3所示的序列，另一段基因片段(HPR R)的核苷酸序列优选包含SEQ ID NO.4所示的序列；所述分裂过氧化物酶APEX2的一段基因片段(AP)的核苷酸序列优选包含SEQ ID NO.5所示的序列，另一段基因片段(Ex2)的核苷酸序列优选包含SEQ ID NO.6所示的序列。本专利技术所述分裂荧光素酶优选包括海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、发红光叩甲虫荧光素酶或发绿光叩甲虫荧光素酶。本专利技术对所述表达纯化的方法并没有特殊限定，优选包括真核表达后纯化或原核表达后纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定性和定量测定蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据待测蛋白质种类，筛选分别与待测蛋白质的不同表位特异性结合的第一蛋白和第二蛋白，第一蛋白和第二蛋白间无相互作用；(2)将第一蛋白的编码基因与报告酶的一段基因片段融合后，表达纯化得第一融合蛋白；将第二蛋白的编码基因与报告酶的另一段基因片段融合后，表达纯化得第二融合蛋白；(3)将包含待测蛋白质的溶液与第一融合蛋白和第二融合蛋白混合孵育，将孵育产物和所述报告酶的底物混合后，检测光强度，从而检测所述溶液中所述待测蛋白质存在与否和所述待测蛋白质的含量。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，当步骤(1)中所述待测蛋白质为免疫球蛋白G时，第一蛋白的种类包括Protein G或Protein L，第二蛋白的种类包括Protein L或Protein G。3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(2)所述报告酶包括荧光素酶NanoLuc@、分裂辣根过氧化物酶、分裂过氧化物酶APEX2或分裂荧光素酶。4.根据权利要求3所述方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘郁林，包煜贤，屈义，
申请(专利权)人：广州辉骏生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：