一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，属于分子生物学领域，本发明专利技术包括如下步骤：步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶加ddATP修复；步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA的CpG岛；步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3

【技术实现步骤摘要】
一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是在真核生物体中一种DNA化学修饰，可以在不改变DNA序列的情况下改变遗传表现。DNA甲基化通常出现在CpG二核苷酸，通过甲基转移酶的作用增加在胞嘧啶的5
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碳位增加一个甲基基团。甲基化可以通过亲代细胞遗传给子代细胞，也可以在细胞中从头合成。甲基化程度作为一种可逆的DNA修饰方式，参与基因表达的调控，异常的高甲基化或低甲基化会引起各种疾病，所以可以作为细胞和生物体健康的检测标准。
[0003]通过结合基因组DNA的亚硫酸氢盐转化技术和高通量测序技术，可以对基因组的甲基化进行测序。简化代表性甲基化测序通过使用对甲基化不敏感的酶富集CpG岛区域，再通过亚硫酸氢盐转化、测序，可以实现单碱基检测的高分辨率和测序数据的高利用率。
[0004]基于甲基化信号的高灵敏、位点多、有组织特异性等特点，在临床实践中可以广泛应用于癌症早筛、疗效监控、组织溯源等领域。在临床实践中，石蜡包埋是一种常见的保存组织样本的手段，可以长时间保存组织细胞的形态特征，便于病理诊断。然而，福尔马林浸泡过程中，对细胞核中基因组DNA的损伤较大，造成提取出的基因组DNA有较多断裂的小片段，这些断裂的基因组DNA连接接头、进入文库，造成了大量的数据浪费，稀释了酶切对于CpG岛的富集作用。所以，利用传统RRBS构建FFPE DNA文库失败率较高，给甲基化测序技术在临床上的发展和推广带来了阻碍。市场需要一种能够阻碍基因组DNA与甲基化接头的连接，使酶切富集CpG岛区域的效果得到放大的同时，通过使用相同的缓冲液，使操作流程简单，减少试剂和人员成本，减少反复纯化造成的DNA损失，并且容易转化成自动化建库流程的技术，本专利技术解决这样的问题。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，本专利技术通过DNA末端修饰加双脱氧ATP（ddATP）以阻止非酶切DNA片段与后续甲基化接头连接，从而能够解决福尔马林浸泡造成的RRBS构建FFPE DNA文库失败率高的问题。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，包括如下步骤：步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复；步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA；
步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3
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端加A
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Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3
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端；步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合；步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于
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80℃下；步骤六，甲基化文库 PCR富集；步骤七，通过凝胶电泳对每一个混合样本，条带在170
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400bp的DNA 片段进行切胶回收，再对切胶回收的文库进行质控和混合，最后进行Illumina平台测序，测序上样量按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成。
[0007]进一步的，步骤一中的石蜡包埋的组织样本为石蜡包埋18个月以内的组织样本。
[0008]进一步的，末端修饰酶包括：Klenow Exo
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酶、DNA聚合酶中的一种或多种的组合。
[0009]进一步的，步骤二中的限制性内切酶为MspI、HaeIII中的一种或多种的组合。
[0010]进一步的，步骤四中的甲基化接头为两条单链互补核酸在98℃水浴5分钟，关闭水浴锅，自然冷却到室温25℃完成退火后，形成的Y型双链结构，两条单链核酸中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的，Y型接头的底部核酸的5
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端做磷酸化处理；3
’
端包含一个6个核苷酸组成的标签序列。
[0011]进一步的，甲基化接头包括：RRBS
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1，RRBS
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2，RRBS
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3，RRBS
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4，RRBS
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5，RRBS
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6，RRBS
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7，RRBS
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8，RRBS
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9，RRBS
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10，RRBS
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11，RRBS
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12；RRBS
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1的上游序列如SEQ01，下游序列如SEQ13；RRBS
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2的上游序列如SEQ02，下游序列如SEQ14；RRBS
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3的上游序列如SEQ03，下游序列如SEQ15；RRBS
‑
4的上游序列如SEQ04，下游序列如SEQ16；RRBS
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5的上游序列如SEQ05，下游序列如SEQ17；RRBS
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6的上游序列如SEQ06，下游序列如SEQ18；RRBS
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7的上游序列如SEQ07，下游序列如SEQ19；RRBS
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8的上游序列如SEQ08，下游序列如SEQ20；RRBS
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9的上游序列如SEQ09，下游序列如SEQ21；RRBS
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9的上游序列如SEQ10，下游序列如SEQ22；RRBS
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10的上游序列如SEQ11，下游序列如SEQ23；RRBS
‑
11的上游序列如SEQ12，下游序列如SEQ24。
[0012]进一步的，步骤四中的DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
[0013]进一步的，步骤六中的甲基化文库 PCR富集的具体方法包括：在对文库富集前，取部分亚硫酸氢盐转化后的文库进行PCR循环数优化；将得到的PCR反应混合物分别分配到各个PCR孔中，离心 PCR板孔，进行后续PCR扩增，从10个PCR循环数开始，依次递增2个循环至确立可以获得可靠文库的最适循环数；再将剩余的亚硫酸氢盐转化后的文库根据最适循环数进行扩增，纯化，洗脱文库DNA。
[0014]进一步的，步骤六中的甲基化文库 PCR富集的扩增引物包括：Universal Primer SEQ25，RRBS
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R701 SEQ26，RRBS
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R702 SEQ27，RRBS
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R703 SEQ28，RRBS
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R704 SEQ29，RRBS
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R705 SEQ30和RRBS
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R706 SEQ31。
[0015]采用上述技术方案后，本专利技术的有益之处在于：本专利技术的方法可用于大规模利用F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复；步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA；步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3
’
端加A
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Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3
’
端；步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合；步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于
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80℃下；步骤六，甲基化文库 PCR富集；步骤七，通过凝胶电泳对每一个混合样本，条带在170
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400bp的DNA 片段进行切胶回收，再对切胶回收的文库进行质控和混合，最后进行Illumina平台测序，测序上样量按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成。2.根据权利要求1所述的一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，所述步骤一中的石蜡包埋的组织样本为石蜡包埋18个月以内的组织样本。3.根据权利要求1所述的一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，所述末端修饰酶包括：Klenow Exo
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酶、DNA聚合酶中的一种或多种的组合。4.根据权利要求1所述的一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，所述步骤二中的限制性内切酶为MspI、HaeIII中的一种或多种的组合。5.根据权利要求1所述的一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，所述步骤四中的甲基化接头为两条单链互补核酸在98℃水浴5分钟，关闭水浴锅，自然冷却到室温25℃完成退火后，形成的Y型双链结构，两条单链核酸中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的，Y型接头的底部核酸的5
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端做磷酸化处理；3
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端包含一个6个核苷酸组成的标签序列。6.根据权利要求5所述的一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，所述甲基化接头包括：RRBS
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1，RRBS
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2，RRBS
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3，RRBS
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4，RRBS
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5，RRBS
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6，RRBS
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7，RRBS
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8，RRBS
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【专利技术属性】
技术研发人员：谷红仓，王云飞，车仙荣，陶宛琪，钱飞箭，
申请(专利权)人：杭州圣庭医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：