基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法技术

基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法，包括：将亚甲基蓝标记的信号探针与固定探针杂交，固定到金电极表面制备传感基底；通过四价发夹探针，构建多层DNA放大回路；制备比例型电化学传感界面，检测血清中的循环甲基化DNA。本发明专利技术的基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器，利用DNAzyme和催化发夹自组装反应优异的信号放大能力，结合比例法对复杂检测环境的自我矫正能力，构建了简便、灵敏的DNA甲基化电化学传感平台，该方法对相关临床疾病的早期诊断及遗传信息机理研究具有重要意义。诊断及遗传信息机理研究具有重要意义。诊断及遗传信息机理研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法


[0001]本专利技术涉及DNA电化学传感器，具体涉及基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是指DNA甲基转移酶以S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体对CpG岛上的胞嘧啶分子的5位端碳原子进行催化，通过共价键引入一个甲基基团的表观遗传修饰。DNA异常甲基化状态与多种疾病的产生和发展密切相关，包括肿瘤细胞的形成和生长、控制肿瘤抑制基因的活性表达等。因此，DNA甲基化可以作为临床检测的重要标志物，有效检测DNA甲基化对于疾病的早期诊断及遗传机理研究具有重要的意义。
[0003]传统的DNA甲基化检测方法主要有甲基化特异性PCR、内切酶辅助PCR、高效液相色谱等，但这些方法通常操作繁琐、设备昂贵和假阳性高，因此亟需研发简便、灵敏的DNA甲基化检测方法。科学家通过了许多等温DNA扩增回路来提高检测的灵敏度，例如：DNAzyme放大技术、滚环扩增放大、杂交链式反应、环介导的等温扩增、催化发夹自组装(CHA)等。其中，DNAzyme放大技术具有高催化裂解活性和优异的抗水解性能。CHA反应具有优异的放大能力、无酶、等温反应等优点，经典的CHA反应包含两个精心通过的发夹探针，其发夹茎部的部分序列相互互补，由此这两个发夹可以在单链DNA/RNA触发链的催化作用下依次打开，产生100倍放大的热力学稳定的双链结构，从而赋予CHA显著的信号放大能力。此外，比例法通过记录目标物引起两个信号的变化进行检测，可以矫正检测环境的微小变化，能够同步提高检测的精确度和灵敏度。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是利用多层DNA放大回路提供一种灵敏且简便的检测甲基化DNA的比例型电化学传感器。通过将多层DNA放大回路和比例型检测法整合起来，构建一种灵敏的检测循环甲基化DNA的电化学传感器。目标物甲基化DNA引发DNAzyme结构的形成，周期性地剪切底物链，在实现目标物循环利用的同时释放大量的单链片段，该片段可以引发后续的催化发夹自组装CHA反应，产生大量的双链复合产物1，该产物可以进一步引发下一个CHA放大回路，产生新的双链复合产物2，复合产物2通过链置换反应固定到电极上可以嵌插大量的信号物质多柔比星DOX，同时将信号探针MB
‑
SP置换下来，获得显著增强的i
DOX
/i
MB
，从而实现对甲基化DNA的灵敏检测。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0006]基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法，包括步骤：
[0007]S1：首先用piranha溶液浸泡金电极，接着用氧化铝粉末进行打磨处理，并进行电化学清洗；
[0008]S2：将亚甲基蓝标记的信号探针MB
‑
SP与固定探针IP杂交，固定到金电极表面制备传感基底，并用巯基己醇MCH进行封闭，得到MCH/(MB
‑
SP/IP)/AuE；
[0009]S3：分别将四条发夹探针2和4进行退火杂交得到四价发夹探针Q
‑
HP2和Q
‑
HP4；
[0010]S4：取含有甲基化DNA的血清样品与反应溶液1(包括HP1,DP1,DP2,Q
‑
HP2,HP3,Q
‑
HP4和HP5)于MCH/(MB
‑
SP/IP)/AuE界面上进行反应；
[0011]S5：将反应后的传感界面作为工作电极，与Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，置于磷酸盐缓冲溶液和氮气氛围中进行电化学检测。
[0012]优选的，所述步骤S1具体包括：首先将金电极用新配置的piranha溶液(98％H2SO4与30％H2O2按体积比3:1配制)浸泡半个小时，用直径为0.3和0.05μm的氧化铝粉末依次打磨，并分别在蒸馏水和乙醇中超声处理。之后将电极置于0.5M H2SO4溶液中在
‑
0.3至1.55V范围内进行电化学扫描，直至得到稳定的循环伏安曲线。
[0013]优选的，所述步骤S2具体包括：将信号探针MB
‑
SP和固定探针IP混合后在95℃加热10分钟并以1℃/分钟的速度降温至25℃，得到MB
‑
SP/IP双链探针，将其与三(2
‑
羧乙基)膦反应60分钟以打开双硫键，随后滴加到处理好的AuE表面，在避光条件下孵育12小时，冲洗过后再将巯基己醇MCH滴加到传感界面上封闭2小时，从而得到MCH/(MB
‑
SP/IP)/AuE。其中所述MB
‑
SP探针的序列为5
′‑
ACAGTCAAATT
‑
(CH2)6‑
MB
‑3′
(SEQ ID NO.1)，IP的序列为5
′‑
SH
‑
(CH2)6‑
TTTAAAAATTTGACTGTCAAATT
‑
3(SEQ ID NO.2)。
[0014]优选的，所述步骤S3具体包括：将四条发夹探针2混合后在95℃加热10分钟并以1℃/分钟的速度降温至25℃，得到四价发夹探针Q
‑
HP2，并用同样的方法制得Q
‑
HP4，其中所述HP2
‑
1的序列为5
′‑
AGATGATACTGGTGGCATGTTGAATTTTTTAGTTCTACTCTAAGTAGCTCGCTTATCCAATGGAGCTACTTAGAATCGCTAGGTTC
‑3′
(SEQ ID NO.3)，
[0015]HP2
‑
2的序列为5
′‑
TTCAACATGCCATATCAGTACCTCTTTTTTAGTTCTACTCTAAGTAGCTCGCTTATCCAATGGAGCTACTTAGAATCGCTAGGTTC
‑3′
(SEQ ID NO.4)，
[0016]HP2
‑
3的序列为5
′‑
GAAGTACTGATACCACTGATCTAATTTTTTAGTTCTACTCTAAGTAGCTCGCTTATCCAATGGAGCTACTTAGAATCGCTAGGTTC
‑3′
(SEQ ID NO.5)，
[0017]HP2
‑
4的序列为5
′‑
TTAGATCAGTGGCCAGTATCATCTTTTTTTAGTTCTACTCTAAGTAGCTCGCTTATCCAATGGAGCTACTTAGAATCGCTAGGTTC
‑3′
(SEQ ID NO.6)，
[0018]HP4
‑
1的序列为5
′‑
AGATGATACTGGTGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法，其特征在于，包括步骤：S1：首先用piranha溶液浸泡金电极，接着用氧化铝粉末进行打磨处理，并进行电化学清洗；S2：将亚甲基蓝标记的信号探针MB
‑
SP与固定探针IP杂交，固定到金电极表面制备传感基底，并用巯基己醇MCH进行封闭，得到MCH/(MB
‑
SP/IP)/AuE；S3：分别将四条发夹探针2和4进行退火杂交得到四价发夹探针Q
‑
HP2和Q
‑
HP4；S4：取含有甲基化DNA的血清样品与反应溶液1(包括HP1,DP1,DP2,Q
‑
HP2,HP3,Q
‑
HP4和HP5)于MCH/(MB
‑
SP/IP)/AuE界面上进行反应；S5：将反应后的传感界面作为工作电极，与Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，置于磷酸盐缓冲溶液和氮气氛围中进行电化学检测。2.根据权利要求1所述的基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：首先将金电极用新配置的piranha溶液浸泡半个小时，用直径为0.3和0.05μm的氧化铝粉末依次打磨，并分别在蒸馏水和乙醇中超声处理；之后将电极置于0.5M H2SO4溶液中在
‑
0.3至1.55V范围内进行电化学扫描，直至得到稳定的循环伏安曲线。3.根据权利要求1所述的基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：将信号探针MB
‑
SP和固定探针IP混合后在95℃加热10分钟并以1℃/分钟的速度降温至25℃，得到MB
‑
SP/IP双链探针，将其与三(2
‑
羧乙基)膦反应60分钟以打开双硫键，随后滴加到处理好的AuE表面，在避光条件下孵育12小时，冲洗过后再将巯基己醇MCH滴加到传感界面上封闭2小时，从而得到MCH/(MB
‑
SP/IP)/AuE；其中所述MB
‑
SP探针的序列为5
′‑
ACAGTCAAATT
‑
(CH2)6‑
MB
‑3′
，IP的序列为5
′‑
SH
‑
(CH2)6‑
TTTAAAAATTTGACTGTCAAATT
‑3′
。4.根据权利要求1所述的基于多层DNA放大回路检测甲基化DNA的比例型电化学传感器的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：将四条发夹探针2混合后在95℃加热10分钟并以1℃/分钟的速度降温至25℃，得到四价发夹探针Q
‑
HP2，用同样的方法制得Q
‑
HP4，其中所述HP2
‑
1的序列为5
′‑
AGATGATACTGGTGGCATGTTGAATTTTTTAGTTCTACTCTAAGTAGCTCGCTTATCCAATGGAGCTACTTAGAATCGCTAGGTTC
‑3′
，HP2
‑
2的序列为5
′‑
TTCAACATGCCATATCAGTACCTCTTTTTTAGTTCTACTCTAAGTAGCTCGCTTATCCAATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：豆保婷，周慧，王颇，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：