一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器制造技术

本发明专利技术属于传感器技术领域，涉及一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器。基于OTA及其适配体的特异性识别、SDA反应、HCR反应以及DNA四面体的特殊性质构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补OTA现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。准确的定量检测。准确的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器


[0001]本专利技术属于传感器
，涉及一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素 A(ochratoxin A， OTA)是曲霉属和青霉属等有毒真菌产生的一类次级代谢产物， 是常见污染食品的五大真菌毒素之一， 具有较强的肾毒性、肝毒性、神经毒性和免疫毒性， 以及致畸、致癌和致突变作用。OTA 广泛存在于各种谷物及其制品、葡萄与葡萄酒、咖啡等多种食品原料及其成品中， 严重威胁人体健康。
[0003]针对食品中 OTA 的检测， 目前已有许多方法，如薄层色谱法、高效液相色谱法、液相
‑
质谱联用法以及酶联免疫吸附法等。这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应OTA检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测OTA的残留。

技术实现思路

[0004]为了实现更加灵敏、特异性的检测OTA，本申请提出了一种目标与适配体特异性结合释放触发链Tr，经链置换触发电极表面DNA四面体封闭链释放，进而引发HCR反应使CuNP被电极捕获，最终通过HNO3溶解CuNP导致电位变化构建检测OTA的电化学生物传感器。
[0005]本专利技术的技术方案如下：一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器，包括赭曲霉毒素A的适配体Apt、触发链Tr、发夹探针H1、CuSO4、MOPs 缓冲液 、TM缓冲液、发夹探针H2以及形成四面体的DNA链S1、S2、S3、S4和封闭链B；所述赭曲霉毒素A的适配体Apt的序列为SEQ ID No:1；所述触发链Tr的序列为SEQ ID No:2；所述发夹探针H1的序列为SEQ ID No:3；所述发夹探针H2的序列为SEQ ID No:4；所述S1的序列为SEQ ID No:5；所述S2的序列为SEQ ID No:6；所述S3的序列为SEQ ID No:7；所述S4的序列为SEQ ID No:8；所述封闭链B的序列为SEQ ID No:9；所述赭曲霉毒素A的适配体Apt的序列为： 5
’‑ꢀ
GATC GGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
ꢀ‑3’
；所述触发链Tr的序列为： 5
’‑ꢀ
TGTCCGATGCGGC TTTTTTTTTT CACCCGATC
ꢀ‑3’
；所述发夹探针H1的序列为： 5
’‑ꢀ
GGGCGCCCGCGCG TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTCGCGCGGGGG
ꢀ‑3’
；
所述发夹探针H2的序列为：5
’‑ꢀ
GCCCCCCCCGCGCGCG TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CGCG
ꢀ‑3’
；所述S1的序列为：5
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GGCGCCCGCCGCATCGGACAACGGAGAACAAAC AACCTTTGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACG
ꢀ‑3’
；所述S2的序列为：5
’‑ꢀ
SH(CH3)6‑ꢀ
CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GG TTT C TTGCTGACAGCGAACTAG AAT GCC C TTT GG GCT GTT CCG GGT GTG GCTCGT CGG
ꢀ‑3’
；所述S3的序列为：5
’‑ꢀ
SH(CH3)6‑ꢀ
GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GG TTT G GaG AACTGG TCC CGT CTA CTT ACC G TTT CC GAC GAG CCA CAC CCGGAA CAG CCC
ꢀ‑3’
；所述S4的序列为：5
’‑ꢀ
SH(CH3)6‑ꢀ
GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GC TTT C CGC AGCGGA GCA GGA GTC CTC GGC C TTT GG GCA TTC TAGTT
ꢀ‑3’
；所述封闭链B的序列为：5
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CGCTGTCAGCAAGGAAGAAACA TTT ATGCGGCGGG TTTGGACCAGTTCTCC
ꢀ‑3’
；所述的S2、S3、S4链的5
’ꢀ
端修饰有巯基
‑
SH。
[0006]优选地，赭曲霉毒素A与赭曲霉毒素A的适配体Apt特异性结合，释放触发链Tr，在电极上依次进行链置换暴露封闭链B、杂交链式反应捕获大量CuNP及其溶解导致电位变化产生电化学信号。
[0007]上述检测赭曲霉毒素A的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）铜纳米颗粒CuNP的制备：H1、CuSO4在 MOPs 缓冲液中混合，再加入还原剂抗坏血酸钠，合成铜纳米颗粒H1
‑
CuNP；H2、CuSO4在 MOPs 缓冲液中混合，再加入还原剂抗坏血酸钠，合成铜纳米颗粒H2
‑
CuNP；（2）对电极进行预处理；（3）DNA四面体制备及其修饰到步骤（2）处理的电极表面：将S1、S2、S3、S4和封闭链B在TM缓冲液中混合，得到DNA四面体；将制备好的DNA四面体与三(2
‑
羧乙基)膦注入电极，在室温下反应；（4）均相反应产生触发链Tr：赭曲霉毒素A的适配体Apt和触发链Tr，振荡，形成拱形探针AP；灭菌水，5
×
PBS缓冲液，拱形探针AP，赭曲霉毒素A孵育；（5）电极上的链置换、杂交链式反应、CuNP的捕获及其溶解反应：将步骤（4）得到的触发链Tr、H1
‑
CuNP和H2
‑
CuNP，滴加到步骤（3）的电极上，反应，清洗。
[0008]优选地，所述步骤（2）预处理过程为：电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗。
[0009]优选地，所述步骤（3）DNA四面体的制备方法为：将等摩尔量的DNA四面体五条链混合在TM缓冲液中，在95℃反应，再逐渐冷却到4℃。
[0010]优选地，所述步骤（3）将DNA四面体修饰到电极表面的过程为：将制备好的DNA四面体与三(2
‑
羧乙基)膦（TCEP）注入电极，在室温下反应过夜。
[0011]优选地，所述步骤（2）的电极为金电极。
[0012]上述制备方法制备的检测赭曲霉毒素A的生物传感器在检测食品、环境中赭曲霉毒素A上的应用。
[0013]上述的应用，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为
‑
0.2到0.6V，电位增加0.004 V本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器，其特征在于，包括赭曲霉毒素A的适配体Apt、触发链Tr、发夹探针H1、CuSO4、MOPs 缓冲液 、TM缓冲液、发夹探针H2以及形成四面体的DNA链S1、S2、S3、S4和封闭链B；所述赭曲霉毒素A的适配体Apt的序列为SEQ ID No:1；所述触发链Tr的序列为SEQ ID No:2；所述发夹探针H1的序列为SEQ ID No:3；所述发夹探针H2的序列为SEQ ID No:4；所述S1的序列为SEQ ID No:5；所述S2的序列为SEQ ID No:6；所述S3的序列为SEQ ID No:7；所述S4的序列为SEQ ID No:8；所述封闭链B的序列为SEQ ID No:9；所述的S2、S3、S4链的5
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端修饰有巯基
‑
SH。2.根据权利要求1所述的检测赭曲霉毒素A的生物传感器，其特征在于，赭曲霉毒素A与赭曲霉毒素A的适配体Apt特异性结合，释放触发链Tr，在电极上依次进行链置换暴露封闭链B、杂交链式反应捕获大量CuNP及其溶解导致电位变化产生电化学信号。3.一种权利要求1所述的检测赭曲霉毒素A的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）铜纳米颗粒CuNP的制备：H1、CuSO4在 MOPs 缓冲液中混合，再加入还原剂抗坏血酸钠，合成铜纳米颗粒H1
‑
CuNP；H2、CuSO4在 MOPs 缓冲液中混合，再加入还原剂抗坏血酸钠，合成铜纳米颗粒H2
‑
CuNP；（2）对电极进行预处理；（3）DNA四面体制备及其修饰到步骤（2）处理的电极表面：将S1、S2、S3、S4和封闭链B在TM缓冲液中混合，得到DNA四面体；将制备好的DNA四面体与三(2
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羧乙基)膦注入电极，在室温下反应；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘素，张清心，黄加栋，王玉，李倩茹，李静静，徐婉晴，朱志学，朱镜儒，姚玉颖，李宗强，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：