基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及方法。本发明专利技术利用45

【技术实现步骤摘要】
基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及方法


[0001]本专利技术涉及光片荧光显微成像技术，具体涉及一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及其成像方法。

技术介绍

[0002]光学显微成像技术凭借其非接触、低损伤的特点在活体生物研究中具有重要应用。利用荧光染料或基因工程可以对细胞内的各类分子和细胞器进行特异性标记，荧光显微成像技术可以还原细胞内荧光标记的精细结构，并对单个分子或细胞器进行追踪与检测，进而实现对生命本质的探索与调控。但传统荧光显微镜拍摄到的图像无法将离焦荧光基团发射的荧光信号屏蔽，导致其存在非常高的背景噪声。若对整个样品进行三维成像，荧光基团不得不被多次激发，导致严重的光漂白和光毒性。而一次选择性激发一个平面的光片荧光显微成像技术可以很好地解决这个问题。
[0003]相对于传统荧光显微镜，光片荧光显微技术选用选择性的片状激发方式，对样品进行一次一个平面激发，该平面外其余区域不激发，显著地减少了无效曝光，从而有效地降低了光漂白和光损伤。与此同时，该激发平面同时位于探测物镜的焦平面，探测物镜与激发物镜正交放置，因此，相对于传统荧光显微镜点扫描的成像方式，光片荧光显微技术的宽场成像方式大大提高了系统的成像速度。
[0004]光片荧光显微技术自提出以来得到了飞速发展，然而由于其本身激发光片位于探测物镜焦平面的特性，大多采用两个倾斜物镜正交放置分别进行样品的激发与荧光信息的收集。而通常使用物镜为高数值孔径物镜，工作距离有限，致使光路调节非常复杂。且光路的复杂性会降低其与其它模态同时成像的适用性，限制了光片显微成像技术的进一步发展。单物镜成像光片成像技术被提出，但该技术对光的利用率较低，且光路调节十分复杂。

技术实现思路

[0005]为了解决上述提到的光片荧光显微成像的局限问题，本专利技术提供一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及其成像方法，通过对样品槽进行特殊设计，常规的透射式显微成像光路即可实现光片成像，光路简单，且能够与多种成像模式相结合，进一步拓展了光片显微成像技术的应用范围。
[0006]本专利技术的一个目的在于提出一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置。
[0007]本专利技术的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置包括：激光光源、高斯光扩束准直装置、空间光场调控装置、聚焦透镜、数字扫描装置、4f中继系统、激发物镜、接收物镜、平移台、第一管镜、第一相机、样品架、压电扫描系统、白光照明系统和控制装置；其中，样品架包括平板、通光孔、微棱镜固定装置、微管固定装置、微管和45
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微棱镜，平板的中间开设有贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置有微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置有微管固定装置，通光孔的底部为竖直放置
的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45
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微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45
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微棱镜的斜角边面为反射面，45
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微棱镜的第一直角边面位于x
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y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩形，则45
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微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的截面为圆形，则45
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微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面；在45
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微棱镜的反射面的上方为竖直放置的接收物镜，样品位于微管内；样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统上；接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控制装置；激光光源发射出线偏振高斯光束；线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场调控装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作为激发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向；聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通过聚焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚焦，激发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后焦平面处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光束的y
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z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光；荧光入射到45
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微棱镜的反射面后反射成x
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y平面，直接由竖直放置的接收物镜收集；经第一管镜会聚成像到第一相机上；第一相机直接接收样品的二维图像；同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中样品位于激发物镜的前焦平面；控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步；压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。
[0008]高斯光扩束准直装置包括焦距不同的两个透镜，其中，焦距不同的两个透镜对激光器出射的线偏振高斯光束的准直状态和光斑直径进行调制，从而出射准直光，且光斑的直径与空间光调制器的液晶面板相适配。
[0009]空间光场调控装置包括二分之一波片、96
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棱镜和空间光调制器；其中，二分之一波片对扩束准直后的线偏振高斯光束进行偏振态调制，使其与空间光调制器的硅基液晶晶体偏振方向相适配；96
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棱镜对光路进行折叠，偏振态呈水平偏振的线偏振光经96
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反射棱镜反射后投射到空间光调制器的硅基液晶面板上，通过空间光调制器上加载不同的相位全息图，产生无衍射光束，无衍射光束为贝塞尔(Bessel)光束或者艾利(Airy)光束，调制后的光场再次被96
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反射棱镜反射至光路中，入射角与反射角之间的夹角为6
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，使得达到空间光调制器最高的调制效率。空间光调制器为纯相位型硅基液晶空间光调制器，液晶分子为平行排列的向列型液晶分子，整体呈现单轴晶体性质。液晶空间光调制器通过调制每一个像元中液晶分子的主轴方向实现像素化的折射率变化的均匀厚度液晶面板。因此，空间光调制器对入射光的偏振态要求很高。且进行全息图加载前，需确定电压占空比与相位调制值
之间的关系，即伽马校正。通过对入射光场加载合适的相位全息图，进而得到所期望的出射光场分布。通过盖师贝格
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撒克斯通(Gerchberg
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置包括：激光光源、高斯光扩束准直装置、空间光场调控装置、聚焦透镜、数字扫描装置、4f中继系统、激发物镜、接收物镜、平移台、第一管镜、第一相机、样品架、压电扫描系统、白光照明系统和控制装置；其中，样品架包括平板、通光孔、微棱镜固定装置、微管固定装置、微管和45
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微棱镜，平板的中间开设有贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置有微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置有微管固定装置，通光孔的底部为竖直放置的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45
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微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45
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微棱镜的斜角边面为反射面，45
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微棱镜的第一直角边面位于x
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y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩形，则45
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微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的截面为圆形，则45
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微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面；在45
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微棱镜的反射面的上方为竖直放置的接收物镜，样品位于微管内；样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统上；接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控制装置；激光光源发射出线偏振高斯光束；线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场调控装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作为激发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向；聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通过聚焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚焦，激发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后焦平面处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光束的y
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z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光；荧光入射到45
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微棱镜的反射面后反射成x
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y平面，直接由竖直放置的接收物镜收集；经第一管镜会聚成像到第一相机上；第一相机直接接收样品的二维图像；同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中样品位于激发物镜的前焦平面；控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步；压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。2.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述高斯光扩束准直装置包括焦距不同的两个透镜，其中，焦距不同的两个透镜对激光器出射的线偏振高斯光束的准直状态和光斑直径进行调制，从而出射准直光，且光斑的直径与空间光调制器的液晶面板相适配。3.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述空间光场调控装置包括二分之一波片、96
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棱镜和空间光调制器；其中，二分之一波片
对扩束准直后的线偏振高斯光束进行偏振态调制，使其与空间光调制器的硅基液晶晶体偏振方向相适配；96
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棱镜对光路进行折叠，偏振态呈水平偏振的线偏振光经96
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反射棱镜反射后投射到空间光调制器的硅基液晶面板上，通过空间光调制器上加载不同的相位全息图，产生无衍射光束，无衍射光束为贝塞尔光束或者艾利光束，调制后的光场再次被96
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反射棱镜反射至光路中，入射角与反射角之间的夹角为6
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，使得达到空间光调制器最高的调制效率。4.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述数字扫描装置为一维扫描振镜，通过控制装置控制一维扫描振镜的扫描范围、步进距离和采样点数实现对光束的快速扫描，使聚焦到样品的无衍射光束形成光片。5.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述4f中继系统包括焦距相同的两个透镜，将数字扫描装置所在平面与激发物镜后焦平面的光场分布完全一致。6.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述白光照明系统包括LED白光光源、第二管镜和第二相机，其中，LED白光光源照射样品，由激发物镜收集后，经第二管镜成像到第二相机上，观察样品的x
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y平面信息，并确定微管中的样品处于激发物镜的前焦平面，即处于贝塞尔光束区。7.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：施可彬，王玥，董大山，龚旗煌，杨宏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：