一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合及试剂盒。所述标志物组合包括TERT和CD45，进一步包括CK和细胞核染料。所述标志物组合可用于体液样本中肿瘤细胞的检测，本发明专利技术提供的试剂盒包括所述目标组合物以及红细胞裂解试剂、目标细胞富集试剂。本发明专利技术提供一组新的肿瘤细胞识别标志物TERT+/CK+/CD45

【技术实现步骤摘要】
一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合及试剂盒。

技术介绍

[0002]癌症在全球范围内发病率和致死率高，已经严重威胁人类健康。液体活检是近年来出现的肿瘤无创检测新技术。由于肿瘤转移导致其细胞从原位脱落进入循环系统，进而向包括血液、胸腔积液、脑脊液甚至尿液中播散。从这些液体样本检测游离的稀有肿瘤细胞及其分子特征可代替对肿瘤原位病灶的活检，因此被成为液体活检。由于病灶活检存在创伤且在大部分情况下难以对患者进行二次活检，因此液体活检，尤其是针对血液的液体活检，由于其无创且易于获得样本，所以受到临床很大的欢迎。
[0003]目前在市场上及学术界存在较多的检测血液中循环肿瘤细胞检测技术与设备，主要采用先富集后鉴定的两步检测模式。虽然对肿瘤细胞的富集方法众多，但最终鉴定肿瘤细胞的方法却极为有限，基本都采用强生公司获得美国FDA批准的CellSearch系统中所采用的上皮标志物与白细胞标志物相结合的方式来鉴定的。CellSearch系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒对癌症患者7.5毫升血液中肿瘤细胞进行捕获，然后通过细胞固定、透膜、以及三重的免疫荧光染色(DAPI、CK、CD45)，将DAPI+/CK+/CD45
‑
且符合一定形态学标准的细胞定义为肿瘤细胞并计数。
[0004]根据上述方法，CellSearch系统鉴定肿瘤细胞所采用的标志物组合是EpCAM+/CK+/CD45<br/>‑
/DAPI+，其中EpCAM与CK(细胞角蛋白)均为上皮标志物，CD45为白细胞标志物，而DAPI为细胞核标志物。根据上述定义CellSearch系统实际上只能鉴定目标细胞为上皮来源，而不能明确目标细胞的良恶性。因此，当血液中存在良性上皮细胞时，CellSearch易出现假阳性。比如，最新的研究表明在良性疾病患者，甚至健康人的血液中也能检测到循环上皮细胞。另外，由于EpCAM与CK(细胞角蛋白)均为上皮标志物，无法区分上皮来源的肿瘤细胞，例如：膀胱癌，肾癌等尿路上皮癌。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合及试剂盒。主要解决现有技术CellSearch系统鉴定肿瘤细胞易出现假阳性的问题。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合，所述标志物组合包括TERT和CD45。具体为TERT阳性和CD45阴性。
[0008]作为优选实施方案，所述标志物组合还包括CK。
[0009]作为优选实施方案，所述标志物组合还包括细胞核染料。
[0010]作为优选实施方案，所述细胞核染料为DAPI。
[0011]本专利技术还提供一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的试剂盒，所述试剂盒包括所述
的标志物组合。
[0012]作为优选实施方案，所述试剂盒包括0.1
‑
5ug/ml的TERT抗体、0.1
‑
5ug/ml的CK抗体和0.1
‑
5ug/ml的CD45抗体。
[0013]作为优选实施方案，所述检测试剂盒包括如下组分：
[0014]固定液：0.2
‑
10％的多聚甲醛；
[0015]破膜液：0.1
‑
5％的聚乙二醇辛基苯基醚；
[0016]免疫荧光染色液：0.1
‑
5ug/ml的TERT抗体，0.1
‑
5ug/ml的CK抗体，0.1
‑
5ug/ml的CD45抗体，所述的抗体均标记有荧光基团；
[0017]细胞核染料：0.5
‑
5uM的DAPI磷酸盐缓冲液；
[0018]缓冲液II：pH为7.2
‑
7.6浓度为0.15M
‑
0.2M的磷酸盐缓冲液。
[0019]作为优选实施方案，所述抗体标记的荧光基团为FITC，PE或APC。
[0020]作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括红细胞裂解试剂，红细胞裂解试剂包括如下组分：
[0021]红细胞裂解液：0.1
‑
5.0g碳酸氢钾，1
‑
10g氯化氨，0.01
‑
0.1g EDTA
‑
Na2，加双蒸水至1000ml；
[0022]缓冲液I：含0.1
‑
3％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH值为7.2
‑
7.6。
[0023]作为优选实施方案，所述红细胞裂解液的组份为：1.0g碳酸氢钾，8.3g氯化氨，0.037g EDTA
‑
Na2，加双蒸水至1000ml。
[0024]作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括目标细胞富集试剂，目标细胞富集试剂包括如下组分：
[0025]磁珠悬液：0.1
‑
5mg/mL的CD45抗体包被的羧基磁珠；
[0026]缓冲液II：pH为7.2
‑
7.6浓度为0.15M
‑
0.2M的磷酸盐缓冲液。
[0027]关于本专利技术涉及的缩写说明如下：
[0028]TERT：端粒酶逆转录酶
[0029]CK：细胞角蛋白
[0030]CD45：在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原
[0031]DAPI：4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚
[0032]FITC：异硫氰酸荧光素
[0033]PE：藻红蛋白
[0034]APC：异藻蓝蛋白
[0035]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0036]1.本专利技术提供一组新的肿瘤细胞识别标志物组合TERT+/CK+/CD45
‑
/DAPI+，其中TERT为端粒酶逆转录酶。其优势在于：第一、能够显著提高检测的灵敏度和特异性。第二、能够检测上皮来源的肿瘤细胞。
[0037]2.本专利技术监测结果显示，对于尿路上皮癌患者而言，使用传统的EpCAM+/CK+/CD45
‑
/DAPI+检测方法无法对肿瘤细胞及正常细胞进行区分，本专利技术采用的TERT+/CK+/CD45
‑
/DAPI+检测方法则能够明显区分肿瘤细胞和正常细胞。
附图说明
[0038]图1是本专利技术实施例1中采用高速荧光成像设备扫载玻片得到的具有不同荧光特征的细胞图；其中BF为白光下细胞视野，TERT蛋白的检测显示绿色，DAPI为细胞核的染色显示蓝色。
[0039]图2是本专利技术实施例2中肺癌患者胸水样本鉴定的肿瘤细胞荧光图，其中框选出的细胞为TERT阳性、DAPI阳性、CK阴性且CD45阴性。
[0040]图3是本专利技术实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合，其特征在于：所述标志物组合包括TERT和CD45。2.如权利要求1所述的用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合，其特征在于：所述标志物组合还包括CK。3.如权利要求1所述的用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合，其特征在于：所述标志物组合还包括细胞核染料。4.如权利要求3所述的用于体液样本中肿瘤细胞检测的标志物组合，其特征在于：所述细胞核染料为DAPI。5.用于体液样本中肿瘤细胞检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1
‑
4任一项所述的标志物组合。6.如权利要求5所述的用于体液样本中肿瘤细胞检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括0.1
‑
5ug/ml的TERT抗体、0.1
‑
5ug/ml的CK抗体和0.1
‑
5ug/ml的CD45抗体。7.如权利要求5所述的用于体液样本中肿瘤细胞检测的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如下组分：固定液：0.2
‑
10％的多聚甲醛；破膜液：0.1
‑
5％的聚乙二醇辛基苯基醚；免疫荧光染色液：0.1
‑
5ug/ml的TERT抗体，0.1
‑
5ug/ml的CK抗体，0.1
‑
5ug/ml的CD45抗体，所述的抗体均标记有荧光基团；细胞核染料：0.5
‑
5uM的DAPI磷酸盐缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱祺，王晓楠，赵小玉，李振建，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：