一种Ⅳ型胶原测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种Ⅳ型胶原测定试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的Ⅳ型胶原检测试剂盒，通过表面活性剂的组合使用，本发明专利技术提供的Ⅳ型胶原测定试剂盒在提高试剂稳定性的同时兼顾了检测灵敏度，并极大的提高了检测的线性范围，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析，适应性好。适应性好。

【技术实现步骤摘要】
一种Ⅳ型胶原测定试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及体外诊断试剂
，尤其涉及一种Ⅳ型胶原测定试剂盒及 其检测方法。

技术介绍

[0002]胶原是一种纤状糖蛋白，它是由三股螺旋体形成的一肽链网状结构。目前 已发现胶原达10种之多，存在于不同組织。Ⅳ型胶原是构成基底膜的重要成 分。正常肝内基底膜主要存在于血管、淋巴管、胆管周围，肝窦壁处缺乏。在 肝病时随炎症发展，纤维组织増生活跃，纤组织生成过程中有大量胶原沉积， 各种胶原均有所增加，基底膜增生，在增生的胶原中，Ⅳ型胶原是最先增生的， 且转化率快，易形成纤维隔板，破坏正常的肝小叶结构，肝小叶改建，假小叶 形成，从而进入肝硬化。
[0003]Ⅳ型胶原在肝纤维化时有显著变化，在轻度肝损伤合并肝纤维化内胶原总量增 加尚不明显时，血清Ⅳ型胶原含量即可明显增加，其含量的变化能较好的反应 肝纤维化、肝细胞损伤及程度。
[0004]早期肝纤维化或其他脏器纤维化的诊断。Ⅳ型胶原是主要用于观察肝硬化 的指标，其浓度与肝纤维化程度相关，可由血清Ⅳ型胶原浓度推测肝硬化的程 度。
[0005]1.急性肝炎时，虽然有大量肝细胞破坏，但因无明显结缔组织增生，故血清
Ⅳꢀ
型胶原浓度与健康人无显著差异。
[0006]2.慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者，血清Ⅳ型胶原均明显增高，其增高程度依此 为原发性肝癌、肝硬化、慢性活动性肝炎、慢性迁延肝炎、急性病毒性肝炎。 目前已知检测血清Ⅳ型胶原的试剂盒较少，传统方法也存在较大的缺陷，测定 灵敏度不足，操作繁琐，准确度不高等，均不利于临床推广使用。
[0007]目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的Ⅳ型胶原检测试剂，尤其是质量好 的自动化检验试剂。现有的Ⅳ型胶原测定方法主要使用时间分辨荧光免疫层析 法，化学发光免疫分析法等。时间分辨荧光免疫层析法稳定性好，但是灵敏度 不高；化学发光法灵敏度较高，但是试剂稳定性较差，而且需要昂贵的专用化 学发光检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。现有胶乳免 疫比浊法虽然操作简单、快速，但是灵敏度低，线性范围窄。因此亟需开发一 种灵敏度高、特异性强、检测方法简单、适用范围广泛的IV型胶原检测试剂 盒。

技术实现思路

[0008]根据专利技术人先前的研究，发现表面活性剂对于IV型胶原与抗体的结合存 在明显的关联。为了解决现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种Ⅳ型胶原测 定试剂盒，所述试剂盒包括组合的表面活性剂、稳定剂、缓冲液、IV型胶原抗 体、和抗冻剂。
[0009]在一种实施方式中，本专利技术表面活性剂为同时使用F88和聚氧乙烯月桂基 醚的组合，优选的，所述F88和聚氧乙烯月桂基醚的比例为1:1。
[0010]在一种实施方式中，本专利技术中的稳定剂为选自无机盐、防腐剂、细胞保护 剂的一种或几种；
[0011]在一种实施方式中，本专利技术中的无机盐为氯化钠、氯化钾或氯化镁中的一 种或几种，优选的，本专利技术中的无机盐为氯化钠；
[0012]在一种实施方式中，本专利技术中的防腐剂为Proclin 300、苯甲酸、苯甲酸 钠、叠氮钠中的一种，优选的，本专利技术中的防腐剂为Proclin 300；
[0013]在一种实施方式中，本专利技术中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲氨基 丙磺酸(TAPS)缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或者几种，优选的，本专利技术中的 缓冲液为磷酸盐缓冲液；
[0014]在一种实施方式中，本专利技术中的细胞保护剂为卵清蛋白、牛转铁蛋白、 人血清白蛋白、牛血清白蛋白及血蓝蛋白中的一种或者几种，优选的，本专利技术 中的细胞保护剂为牛血清白蛋白。
[0015]在一种实施方式中，本专利技术Ⅳ型胶原抗体，源自动物或人工重组的抗体， 例如兔、羊、鸡、骆驼、小鼠、大鼠。最为优选的，本专利技术Ⅳ型胶原抗体为兔 抗人Ⅳ型胶原抗体。
[0016]在一种实施方式中，所述Ⅳ型胶原抗体可选用Ⅳ型胶原抗体胶乳微球颗 粒，更为优选的，所述抗体与胶乳微球偶联使用的偶联剂为组合型偶联剂，所 述的组合型偶联剂包括有以下组分：碳二亚胺、O
‑
苯并三氮唑
‑
N,N,N”,N
”‑ꢀ
四甲基脲四氟硼酸和O
‑
苯并三氮唑
‑
四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕ 1.2﹕1。
[0017]在一种实施方式中，本专利技术的抗冻剂为甲醇、乙醇、乙二醇、水溶性酰胺 和氯化钙、盐水等的一种或者几种。优选的，本专利技术中的抗冻剂为乙二醇。
[0018]在一种优选的实施方式中，本专利技术的试剂盒至少包含试剂1和试剂2：
[0019]试剂1
[0020][0021]试剂2
[0022][0023][0024]本专利技术取得的有益效果如下：
[0025]1、试剂盒中的具体的物质的制备步骤简单，成本低，更适用于工业生产和临 床推广应用；
[0026]2、申请人通过对表面活性剂的组合筛选，选择了在试剂盒中组合添加了表面 活性剂F88和聚氧乙烯月桂基醚，明显提高了试剂盒的分析灵敏度以及精密度， 扩大检测的线性范围。
[0027]3、通过在试剂盒中添加乙二醇，提高了试剂盒的抗冻能力，使试剂盒可以在 低温的条件下运输或储存仍保持很好的检测性能。
具体实施方式
[0028]以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施 例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0029]实施例1：校准曲线的绘制
[0030]试剂1
[0031][0032]试剂2
[0033][0034][0035]将试剂1、试剂2和胶原校准品包装成试剂盒。
[0036]在日立
‑
7180全自动生化分析仪上的设定参数：
[0037]测定模式终点法样本量6μl试剂1180μl试剂260μl测定温度37℃波长600nm光径1cm反应方向正
[0038]操作步骤
[0039][0040][0041]校准程序
[0042]使用Ⅳ型胶原校准品校准，多点定标，采用非线性校准模式，如Logit、 Spline等。
[0043]结果计算
[0044]五点定标，第
①
管取纯化水，输入值为0.0ng/ml，第
②
～
⑤
管取校准品， 输入相应值。根据吸光度与校准品的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其 吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
[0045]实施例2：线性性能的测定
[0046]将某一高Ⅳ型胶原浓度样本(血清)与某一低Ⅳ型胶原浓度样本做等差混合 稀释，测定稀释后的浓度，测定三次求平均值，再与理论浓度相比较，计算其 线性偏差。可以看出本申请试剂盒线性范围可达30
‑
420ng/ml。
[0047]线性结果
[0048][0049][0050]实施例3：精密度和回收率
[0051]重复测定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Ⅳ型胶原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括稳定剂、缓冲液、IV型胶原抗体、表面活性剂、和抗冻剂，所述表面活性剂为F88和聚氧乙烯月桂基醚的组合，所述稳定剂选自无机盐、防腐剂、细胞保护剂中的一种或几种，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲氨基丙磺酸(TAPS)缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或者几种，所述IV型胶原抗体为源自动物或人工重组的抗体，所述抗冻剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、水溶性酰胺和氯化钙、盐水等的一种或者几种。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为F88：聚氧乙烯月桂基醚＝1:1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：何秋富，陈壮洪，邢力策，
申请(专利权)人：浙江亚培生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：