用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法技术方案

本发明专利技术公开了一种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法，本发明专利技术使用单面无极石英晶片，以肌钙蛋白I或肌红蛋白适配体为探针，通过链霉亲和素

【技术实现步骤摘要】
用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法


[0001]本专利技术属于传感检测
，具体涉及一种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法。

技术介绍

[0002]核酸适配体(aptamer)是通过指数富集的配体进化技术(SELEX)从随机的单链核酸序列中筛选的寡核苷酸序列或者短的多肽，一般是单链DNA或者RNA序列，并对靶标物质具有高特异性和高亲和力。核酸适配体又被称为化学抗体，已广泛应用于传感器的构建。相比抗体而言，核酸适配体具有如下的优点：特异性和亲和性较好；核酸适配体易于合成、纯化及修饰，根据不同的传感器需求可灵活设计；并且其性质稳定，不易受外界环境影响，易于保存。
[0003]急性心肌梗塞(AMI)是全世界发病率和死亡率的主要原因之一。心脏标记物的灵敏检测作为一种有用的诊断工具，对于准确诊断患有AMI症状的患者非常重要。AMI的最佳标志物包括肌钙蛋白I(cTnI)或肌红蛋白(Mb)。一些常规方法已被用于检测肌钙蛋白I或肌红蛋白，例如质谱，液相色谱，电化学和表面等离振子共振(SPR)等。这些方法大多数都显示出高灵敏度，但是这些方法既耗时又需要昂贵的设备，因此无法应用于即时检验(POC)测试。
[0004]现有的基于适配体的石英晶体微天平生物传感器大多使用表面镀金的石英晶体，一方面由于石英晶片容易损耗，成本增加；另一方面，晶体的质量灵敏度与晶体的基频的平方成正比，而基频与晶体的厚度成反比，因此在裸石英面上镀金在一定程度上降低了石英晶体的灵敏度。此外，大多数的基于适配体的石英晶体微天平生物传感器是通过DNA杂交、酶催化底物、磁珠富集等技术进行扩增来提高灵敏度的，但是对DNA、酶这类物质参与的反应需要严格控制反应所需的条件如温度和pH，而基于增量法的磁珠富集技术需要增加清洗步骤以移除未结合的磁珠，增加了许多额外的时间，使其无法在短时间实时检测。
[0005]现有的基于适配体的石英晶体微天平生物传感器一般采用流动注射方式来增加反应发生的概率，从而尽可能对低浓度的待测物进行检测，然而流动注射方式对实验条件很严格，例如在检测中产生的气泡和流速变化都会对频率响应有着极大的影响从而导致检测失败，并且流动注射方式需要的消耗的待测物的量较大。而一些不使用流动注射方式的石英晶体微生物传感器的检测限有限，只能对高浓度的待测物进行检测，主要是因为生物分子在溶液中移动缓慢，大部分无法与晶体表面的受体结合。
[0006]本专利技术基于适配体检测肌钙蛋白I或肌红蛋白为例，利用高频单面无极石英晶体微天平实现对检测物实现灵敏的检测，再结合交变磁场增加待测物与探针的结合概率以及磁珠富集技术进一步提高灵敏度。此外，利用谐振场调幅法区分非特异性结合和特异性结合，建立了高灵敏度和高选择性生物传感器，从而能够高效快速的蛋白质检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、生物选择性好和检测速度快的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法。
[0008]本专利技术这种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统，包括系统控制与数据采集装置、DDS信号发生器、无极石英晶体启振耦合器，相敏检波检测器，温度控制装置、自动进样装置、以及高频单面无极适配体压电石英晶体传感器；系统控制与数据采集装置分别与温度控制装置、自动进样装置、DDS信号发生器、相敏检波检测器相连；DDS信号发生器与无极石英晶体启振耦合器互联；
[0009]高频单面无极适配体压电石英晶体传感器包括有检测池、固定在检测池内的加热装置和固定在检测池内修饰高频单面无极压电石英晶体，以及位于检测池外的磁场发生装置；检测池上开设有进样口和出样口，进样口与自动进样装置相连，加热装置与温度控制装置连接，修饰高频单面无极压电石英晶体的激励线圈与无极石英晶体启振耦合器相连，接收线圈与相敏检波检测器相连；磁场发生装置与系统控制与数据采集装置相连；
[0010]检测过程中，系统控制与数据采集装置使DDS信号发生器产生激励信号，激励信号通过无极石英晶体启振耦合器作用于修饰高频单面无极压电石英晶体，由于修饰高频单面无极压电石英晶体在检测时发生反生，导致信号发生改变，改变信号通过相敏检波检测器检测到信号，输送至系统控制与数据采集装置，即可获得该表的信号；
[0011]自动进样装置控制进样量和进样时间，温度控制装置控制检测时的温度，磁场发生装置用于保证修饰高频单面无极压电石英晶体与检测样品的反应过程。
[0012]本专利技术这种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，包括以下步骤：
[0013]1)修饰高频单面无极压电石英晶体；
[0014]2)制备适配体
‑
磁珠复合物；
[0015]3)制备标准曲线：将步骤1)中修饰的高频单面无极压电石英晶体固定在检测池中，开启传感系统，调节DDS信号发生器的电压为1V，通过自动进样装置向检测池中注入缓冲液，获得平稳的基线后，排出缓冲液；再接着通入设定浓度的心梗标志物和步骤2)的适配体
‑
磁珠复合物，通过磁场发生器产生交变磁场增加反应结合概率，反应时间为30min，关掉交变磁场待频率，稳定后，记录此时的频率f0；通过DDS信号发生器增加电压至10V，使晶体表面振动加剧，除去非特异性物质，稳定后，记录此时的频率f1；然后通过DDS信号发生器增加电压至20V，在20V的高压力下出现频率大幅度增加，键发生断裂，频率稳定后，记录键断裂后的谐振频率f2；计算频差Δf＝f2‑
f1，获得对应的传感信号，改变心梗标志物的浓度，然后建立浓度与频差Δf的标准曲线；
[0016]4)按照步骤4)中的方法检测未知浓度的心梗标志物，得到频差Δf，然后根据标准曲线即可获得其浓度。
[0017]所述的心梗标志物为肌钙蛋白I或肌红蛋白。
[0018]所述步骤1)中，修饰高频单面无极压电石英晶体的方法有3种。
[0019]所述修饰高频单面无极压电石英晶体的具体方法，包括以下步骤：
[0020]A
‑
1取高频单面无极压电石英晶体于无水乙醇中清洗后氮气吹干，放于紫外照射清洗机中照射8～12min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干；得到处理
后的晶片；
[0021]A
‑
2向经过步骤A
‑
1中处理过的晶片滴15～25μL链霉亲和素溶液于3～5℃过夜孵育，得到链霉素修饰的晶片；
[0022]A
‑
3向经过步骤A
‑
2中链霉素修饰的晶片上滴加15～25μL适配体I溶液，反应2～4h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体Ⅰ溶液的浓度为1.5～2.5μM，适配体I为生物素修饰的肌钙蛋白Ⅰ适配体或者肌红蛋白适配体；生物素修饰肌钙蛋白Ⅰ适配体的序列为5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统，其特征在于，包括系统控制与数据采集装置、DDS信号发生器、无极石英晶体启振耦合器，相敏检波检测器，温度控制装置、自动进样装置、以及高频单面无极适配体压电石英晶体传感器；系统控制与数据采集装置分别与温度控制装置、自动进样装置、DDS信号发生器、相敏检波检测器相连；DDS信号发生器与无极石英晶体启振耦合器互联；高频单面无极适配体压电石英晶体传感器包括有检测池、固定在检测池内的加热装置和固定在检测池内修饰高频单面无极压电石英晶体，以及位于检测池外的磁场发生装置；检测池上开设有进样口和出样口，进样口与自动进样装置相连，加热装置与温度控制装置连接，修饰高频单面无极压电石英晶体的激励线圈与无极石英晶体启振耦合器相连，接收线圈与相敏检波检测器相连；磁场发生装置与系统控制与数据采集装置相连；检测过程中，系统控制与数据采集装置使DDS信号发生器产生激励信号，激励信号通过无极石英晶体启振耦合器作用于修饰高频单面无极压电石英晶体，由于修饰高频单面无极压电石英晶体在检测时发生反生，导致信号发生改变，改变信号通过相敏检波检测器检测到信号，输送至系统控制与数据采集装置，即可获得该表的信号；自动进样装置控制进样量和进样时间，温度控制装置控制检测时的温度，磁场发生装置用于保证修饰高频单面无极压电石英晶体与检测样品的反应过程。2.根据权利要求1所述的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，包括以下步骤：1)修饰高频单面无极压电石英晶体；2)制备适配体
‑
磁珠复合物；3)制备标准曲线：将步骤1)中修饰的高频单面无极压电石英晶体固定在检测池中，开启传感系统，调节DDS信号发生器的电压为1V，通过自动进样装置向检测池中注入缓冲液，获得平稳的基线后，排出缓冲液；再接着通入设定浓度的心梗标志物和步骤2)的适配体
‑
磁珠复合物，通过磁场发生器产生交变磁场增加反应结合概率，反应时间为30min，关掉交变磁场待频率，稳定后，记录此时的频率f0；通过DDS信号发生器增加电压至10V，使晶体表面振动加剧，除去非特异性物质，稳定后，记录此时的频率f1；然后通过DDS信号发生器增加电压至20V，在20V的高压力下出现频率大幅度增加，键发生断裂，频率稳定后，记录键断裂后的谐振频率f2；计算频差Δf＝f2‑
f1，获得对应的传感信号，改变心梗标志物的浓度，然后建立浓度与频差Δf的标准曲线；4)按照步骤4)中的方法检测未知浓度的心梗标志物，得到频差Δf，然后根据标准曲线即可获得其浓度。3.根据权利要求2所述的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，其特征在于，所述的心梗标志物为肌钙蛋白I或肌红蛋白。4.根据权利要求3所述的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，修饰高频单面无极压电石英晶体的方法有3种。5.根据权利要求4所述的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，其特征在于，所述修饰高频单面无极压电石英晶体的具体方法，包括以下步骤：A
‑
1取高频单面无极压电石英晶体于无水乙醇中清洗后氮气吹干，放于紫外照射清洗机中照射8～12min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干；得到处理后的
晶片；A
‑
2向经过步骤A
‑
1中处理过的晶片滴15～25μL链霉亲和素溶液于3～5℃过夜孵育，得到链霉素修饰的晶片；A
‑
3向经过步骤A
‑
2中链霉素修饰的晶片上滴加15～25μL适配体I溶液，反应2～4h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体Ⅰ溶液的浓度为1.5～2.5μM，适配体I为生物素修饰的肌钙蛋白Ⅰ适配体或者肌红蛋白适配体；生物素修饰肌钙蛋白Ⅰ适配体的序列为5
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；生物素修饰肌红蛋白适配体序列为5
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；A
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4用缓冲溶液I冲洗步骤A
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3中适配体修饰后的晶片，接着滴加15～25μL封闭剂，并进行封闭反应0.5～1.5h，封闭完毕后，缓冲溶液I，双蒸水分别清洗，得到修饰探针的高频单面无极压电石英晶体，然后置于4℃下保存备用；其中：缓冲溶液I为PBS缓冲液，pH为7.4，浓度为10mM；封闭剂为0.1wt％的牛血清蛋白溶液。6.根据权利要求4所述的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，其特征在于所述修饰高频单面无极压电石英晶体的具体方法，包括以下步骤：B
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1将高频单面无极压电石英晶体于piranha酸处理10～20min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干，得到处理过的晶片；其中：piranha酸为浓硫酸:30％H2O2＝3:1；B
‑
2向经过步骤B
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1处理过的晶片滴加15～25μL的3
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氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中固定1～2h，得到APTES修饰的晶片；其中：3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的浓度为2
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5wt％，溶剂为无水甲苯；B
‑
3用缓冲溶液I冲洗步骤B
‑
2中APTES修饰的晶片，接着在晶片上滴加15～25μL戊二醛溶液进行反应0.5～2h；得到戊二醛处理的晶片；其中戊二醛溶液浓度为2.5～5wt％；B
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4用缓冲溶液I冲洗步骤三戊二醛处理的晶片，接着在晶片滴20μL2μM适配体I溶液，反应2～4h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体Ⅱ溶液的浓度为1.5～2.5μM，适配体Ⅱ为氨基修饰的肌钙蛋白Ⅰ适配体或者肌红蛋白适配体，氨基修饰的肌钙蛋白Ⅰ适配体的序列为5
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NH2(CH2)6‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：司士辉，余建芳，王桢昌，周卓，邓如悦，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：