一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液制造技术

本发明专利技术涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液。本发明专利技术所提供的用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，包括含有渗透保护剂、细胞膜保护剂和细胞稳定剂的PBS缓冲液和添加剂，所述PBS缓冲液中渗透保护剂的体积百分比为5～10％，细胞膜保护剂的质量体积比为1～3％，细胞稳定剂的质量体积比为1～6％；所述添加剂包括L

【技术实现步骤摘要】
一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液


[0001]本专利技术涉及细胞保存
，具体涉及一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液。

技术介绍

[0002]细胞冻存是将细胞放在低温环境、减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于
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196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存时向培养基中加入冻存保护剂，可以使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
[0003]传统冻存液在降温过程中需要采用“慢冻快融”的方法才能较好地保证细胞存活，标准冷冻速度开始为
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1～
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2℃/min，当温度低于
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25℃时可加速，到
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80℃之后可直接投入液氮内(
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196℃)。该过程中需要使用多种昂贵的低温冰箱设备，同时需要程序降温盒，时间周期长、操作复杂，不利于批量冻存操作，过程易出错；如果直接放进液氮，会导致细胞全部死亡。另外一种是“快冻快融”，叫玻璃化冻存，虽然可以直接放置液氮冻存，但冷冻液操作流程非常复杂，而且由于所用冻存液浓度高，对细胞损伤大，应用范围极有限，无法大范围推广。
[0004]基于此，专利技术人经过研究提供了一种新的冻存管结构，具体可参见申请日为2021年7月13日，申请号为202121595540.0的技术专利，专利技术人进一步采用现有的冻存液进行实验，发现复苏后细胞的活率和贴壁率仍旧不够理想。公知的，细胞的活率和贴壁率是冻存细胞效果评价的基本指标，提高细胞的活率和贴壁率对于后续实验研究具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]为了进一步提高冻存细胞的活率和贴壁率，本专利技术的目的在于提供一种新的用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，其不同之处在于，包括含有渗透保护剂、细胞膜保护剂和细胞稳定剂的PBS缓冲液和添加剂，所述PBS缓冲液中渗透保护剂的体积百分比为5～10％，细胞膜保护剂的质量体积比为1～3％，细胞稳定剂的质量体积比为1～6％；所述添加剂包括L
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谷氨酰胺、谷丙二肽和丙酮酸钠。
[0006]该冻存液不含有血清和蛋白，不存在病毒、支原体感染的风险，且配制方便，批间差异小，将其配合专用的冻存管用于细胞冻存，对细胞伤害小，细胞复苏后的活力和贴壁率均能达到85％以上。
[0007]作为本专利技术的一种实施方式，所述L
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谷氨酰胺的摩尔浓度为1～4mM，所述谷丙二肽的摩尔浓度为0.5～2mM，所述丙酮酸钠的摩尔浓度为0.5～2mM。
[0008]作为本专利技术的一种实施方式，所述渗透保护剂为二甲基亚砜、甘油、乙酰胺、乙二醇中的一种。
[0009]作为本专利技术的一种实施方式，所述细胞膜保护剂为海藻糖、蔗糖中的一种或两种。
[0010]作为本专利技术的一种实施方式，所述细胞稳定剂为羟乙基淀粉、糖酐中的一种或两种。
[0011]作为本专利技术的一种实施方式，所述糖酐为糖酐4万。
[0012]作为本专利技术的一种实施方式，所述冻存液还包括还原型谷胱甘肽，所述还原性谷胱甘肽的质量体积比为0.5～1％。
[0013]作为本专利技术的一种实施方式，所述冻存液包括含有乙酰胺、海藻糖和羟乙基淀粉的PBS缓冲液和添加剂，所述PBS缓冲液中乙酰胺的体积百分比为5％，海藻糖的质量体积比为2.5％，羟乙基淀粉的质量体积比为3％；所述添加剂包括L
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谷氨酰胺、谷丙二肽、丙酮酸钠和还原型谷胱甘肽，所述L
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谷氨酰胺的摩尔浓度为2mM，所述谷丙二肽的摩尔浓度为1mM，所述丙酮酸钠的摩尔浓度为1mM，所述还原性谷胱甘肽的质量体积比为0.8％。
[0014]本专利技术所提供的冻存液，成分明确，不含有血清和蛋白，批次稳定，且可以避免一些动物源蛋白对后续实验的影响；该冻存液配合专用的冻存管，可以一步到位的将细胞冻存在液氮中，适合批量操作，不涉及到昂贵仪器，节省成本；该冻存液中各成分含量普遍较低，对细胞的损伤小，毒性小，相较于传统冻存液复苏后存活率、贴壁率均较好，且可以长久的保存细胞。
具体实施方式
[0015]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0016]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0017]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0018]实施例1
[0019]本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
[0020]海藻糖2.5％，
[0021]糖酐4万(厂家：上海源叶，货号S14110)2％，
[0022]羟乙基淀粉3％，
[0023]DMSO 5％，
[0024]还原型谷胱甘肽0.8％，
[0025]L
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谷氨酰胺2mM，
[0026]谷丙二肽1mM，
[0027]丙酮酸钠1mM，
[0028]PBS余量。
[0029]实施例2
[0030]本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
[0031]海藻糖2.5％，
[0032]糖酐4万2％，
[0033]羟乙基淀粉3％，
[0034]乙酰胺5％，
[0035]还原型谷胱甘肽0.8％，
[0036]L
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谷氨酰胺2mM，
[0037]谷丙二肽1mM，
[0038]丙酮酸钠1mM，
[0039]PBS余量。
[0040]实施例3
[0041]本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
[0042]海藻糖2.5％，
[0043]糖酐4万2％，
[0044]羟乙基淀粉3％，
[0045]乙酰胺5％，
[0046]L
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谷氨酰胺2mM，
[0047]谷丙二肽1mM，
[0048]丙酮酸钠1mM，
[0049]PBS余量。
[0050]实施例4
[0051]本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
[0052]海藻糖1％，
[0053]糖酐4万3％，
[0054]羟乙基淀粉1％，
[0055]DMSO 8％，
[0056]还原型谷胱甘肽0.8％，
[0057]L
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谷氨酰胺1.5m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，其特征在于，包括含有渗透保护剂、细胞膜保护剂和细胞稳定剂的PBS缓冲液和添加剂，所述PBS缓冲液中渗透保护剂的体积百分比为5～10％，细胞膜保护剂的质量体积比为1～3％，细胞稳定剂的质量体积比为1～6％；所述添加剂包括L
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谷氨酰胺、谷丙二肽和丙酮酸钠。2.根据权利要求1所述的用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，其特征在于，所述L
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谷氨酰胺的摩尔浓度为1～4mM，所述谷丙二肽的摩尔浓度为0.5～2mM，所述丙酮酸钠的摩尔浓度为0.5～2mM。3.根据权利要求1所述的用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，其特征在于，所述渗透保护剂为二甲基亚砜、甘油、乙酰胺、乙二醇中的一种。4.根据权利要求1所述的用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，其特征在于，所述细胞膜保护剂为海藻糖、蔗糖中的一种或两种。5.根据权利要求1所述的用于直接液氮冻存的无...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴亭，尚振波，
申请(专利权)人：武汉普诺赛生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：