一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，包括将样本置于带有疏水膜的多孔筛板中，然后使用DNA酶进行样本裂解提取蛋白质组，选用微量滤板与可吸附蛋白的材料相结合的方法进行纯化除盐，最后解吸附，即得。本发明专利技术方法能够增加批次样本提取数量，有效缩短样本处理时间，摆脱了由仪器设备数量对实验通量的限制，同时提高酶解效率，并避免磁珠碎片进入后续步骤。磁珠碎片进入后续步骤。磁珠碎片进入后续步骤。

【技术实现步骤摘要】
一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法


[0001]本专利技术属于蛋白组学
，具体地，涉及一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法。

技术介绍

[0002]随着蛋白质组学的发展，其相应的液相质谱检测器也在快速发展，样本通量迅速变大，从以前单样本采集时间90
‑
180min，目前可以缩减到10min完成单样本数据采集，同时数据分析平台也在往云平台发展，上千样本同时处理仅需几天时间。然而，样本前处理目前还处在耗时长、效率低的单个样本操作阶段，此时，提高每批次样本数量及方法优化显得尤为重要。
[0003]目前提取样本蛋白质组的方法，需要每个样本单独操作，存在操作繁琐、耗时长、通量小等问题。比如：每个样本单独脱蜡复水工作需耗时至少60
‑
90分钟，而每个人每批次最多操作24个样本，同时耗时会增加为每批次2.5小时。后续接触性超声裂解每个样本耗时10分钟，并且通量受限于仪器数量。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法。
[0005]技术方案：为达到上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，包括将样本置于带有疏水膜的多孔筛板中，然后使用DNA酶进行样本裂解提取蛋白质组，选用微量滤板与可吸附蛋白的材料相结合的方法进行纯化除盐，最后解吸附，洗脱，即得。
[0007]优选的，所述样本为石蜡包埋样本，直接加入到多孔筛板中进行脱蜡复水。
[0008]更优选的，所述多孔筛板中进行脱蜡复水，是依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇离心进行脱蜡复水。
[0009]可选的，所述样本为非石蜡包埋样本，经研磨后直接加入到多孔筛板中。
[0010]优选的，所述多孔筛板为96孔，可选8
‑
96孔。
[0011]优选的，所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，包括以下步骤：
[0012](1)将石蜡包埋样本置于带有疏水膜的多孔筛板，直接在多孔筛板中进行脱蜡复水。
[0013](2)在每个孔中加入裂解液与DNA酶孵育反应一段时间，离心收集每孔蛋白；
[0014](3)将收集后样本加热进行解交联，测定蛋白浓度；
[0015](4)选用还原烷基化试剂进行还原烷基化；
[0016](5)将还原烷基化后蛋白溶液加入可吸附蛋白的材料及相应溶剂后混匀，转移到微量滤板上孵育、清洗及酶解；
[0017](6)用溶剂对酶解后肽段样本进行清洗除盐、解吸附，使其从微量滤板上洗脱下
来。
[0018]进一步优选的：
[0019]步骤(1)中，采用96孔筛板时，优选1μm孔径具有疏水性筛板；依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇离心进行脱蜡复水；实验过程中所有96孔板，均可改造为8联排、12联排、48孔等方式
[0020]步骤(1)也可适用于非石蜡包埋样本，非石蜡样本经研磨后可直接加入多孔筛板中进行后续步骤操作。
[0021]步骤(2)中，所述DNA酶选自DNaseI；
[0022]步骤(3)中，解交联的温度为95℃
‑
100℃。
[0023]步骤(4)中，所述还原烷基化试剂优选DTT与IAM组合；
[0024]步骤(5)中，所述可吸附蛋白的材料选自SP3磁珠，所述微量滤板选自材质为SDB膜材质的微量滤板；所述酶解采用胰蛋白酶进行酶解。
[0025]本专利技术对蛋白质组提取方法及流程进行优化，实验流程如图1所示，使用如96孔筛板提高每批次处理样本数量，实现高通量，并且使用脱氧核糖核酸酶(即DNA酶)裂解提取蛋白质组，摆脱仪器设备限制。同时使用可吸附蛋白的材料与膜相结合的方式进行酶解。该方法增加批次样本提取数量，有效缩短样本处理时间，摆脱了由仪器设备数量对实验通量的限制，同时提高酶解效率，并避免磁珠碎片进入后续步骤。
[0026]有益效果：与与现有单个样本操作方法相比，本方法具有以下优势：
[0027](1)如使用的筛板具有96孔，单个筛板可载样本96个，同时可根据样本数量多少灵活调整，比如8孔、12孔等。
[0028](2)采用脱氧核糖核酸酶处理样本进行蛋白质组提取，在不减少蛋白收率的情况下，有效节约操作时间。
[0029](3)选用可吸附蛋白的材料与微量滤板结合的方法，材料上酶解可以提高酶解效率，微量滤板可避免材料碎片进入上机体系堵塞仪器。同时，微量滤板也可满足96孔高通量操作。
附图说明
[0030]图1为本专利技术方法实验流程示意图。
[0031]图2为样本相关性比较。
具体实施方式
[0032]以下对本专利技术方案进行全面的描述，所述的实施案例是本专利技术中最优选实施方式，但本专利技术并不限于以下实施例。
[0033]实验组
[0034]1.将石蜡卷样本放到疏水性96孔筛板中，依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇，进行脱蜡复水
[0035]2.在每个孔中加入适量裂解液及DNaseI反应
[0036]3.离心用新96孔板收集蛋白，95℃反应1h进行解交联
[0037]4.选用BCA方法测定蛋白浓度
[0038]5.剩余样本加入DTT56℃反应30min
[0039]6.加入IAM室温避光反应30min
[0040]7.将还原烷基化后蛋白溶液加入磁珠混匀
[0041]8.调节pH至酸性，立即加入一定体积乙腈，轻轻震荡混匀
[0042]9.将样本转移至已活化微量SDB筛板中，室温条件下孵育8min，离心弃滤液
[0043]10.使用试剂清洗后，加入酶解体系，37℃反应2
‑
4h
[0044]11.再次加入胰酶，37℃反应3h
[0045]12.酶解反应结束后，加入试剂清洗，离心弃滤液
[0046]13.加入洗脱液洗脱肽段，离心收集滤液
[0047]14.使用超高效液相联合Orbitrap HF进行样本检测，90min梯度，60min有效梯度DDA检测比较
[0048]对照组
[0049]1.将石蜡卷样本放入1.5mL离心管中，依次加入3次二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇，每次孵育10min离心5min弃上清，进行脱蜡复水
[0050]2.加入适量裂解液，接触性超声破碎仪进行超声裂解
[0051]3.95℃反应1h进行样本解交联
[0052]4.BCA方法测定蛋白浓度
[0053]5.剩余样本加入DTT，56℃反应30min
[0054]6.加入IAM室温避光反应30min
[0055]7.将还原烷基化后蛋白溶液加入磁珠混匀
[0056]8.调节pH至酸性，立即加入一定体积乙腈，轻轻震荡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，其特征在于，包括将样本置于带有疏水膜的多孔筛板中，然后使用DNA酶进行样本裂解提取蛋白质组，选用微量滤板与可吸附蛋白的材料相结合的方法进行纯化除盐，最后解吸附，即得。2.根据权利要求1所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，其特征在于，所述样本为石蜡包埋样本，直接加入到多孔筛板中进行脱蜡复水。3.根据权利要求2所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，其特征在于，所述多孔筛板中进行脱蜡复水，是依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇离心进行脱蜡复水。4.根据权利要求1所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，其特征在于，所述样本为非石蜡包埋样本，经研磨后直接加入到多孔筛板中。5.根据权利要求1所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，其特征在于，所述多孔筛板为8
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96孔。6.根据权利要求1所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将石蜡包埋样本置于带有疏水膜的多孔筛板，直接在多孔筛板中进行脱蜡复水；(2)在每个孔中加入裂解...

【专利技术属性】
技术研发人员：范金爽，陈亮宇，宋雷，李捷，
申请(专利权)人：谱天天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：