一种无标记三维超分辨显微方法与装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种无标记三维超分辨显微方法，包括步骤：利用实心照明光束和空心照明光束对无标记样品同时进行二维扫描，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦反射光强度图和由空心光斑调制得到的负共聚焦反射光强度图，并进行差分计算；采用差动测量扫描方法对样品进行扫描测量实现轴向超分辨，一个光电探测器置于焦平面的离焦距离

【技术实现步骤摘要】
一种无标记三维超分辨显微方法与装置


[0001]本专利技术属于激光点扫描显微领域，尤其涉及一种无标记三维超分辨显微方法与装置。

技术介绍

[0002]无标记超分辨率显微镜主要适用于无标记非荧光样品。为了实现无标记的超分辨率显微镜，一种简单的方法就是近场扫描光学显微镜(SNOM)技术，该技术使用超薄纳米尖端检测样品表面的近场信号。但是，低成像速度和尖端与物体表面之间距离的精密控制的要求使得SNOM不太令人满意。在随后的发展中，科学家使用了一些纳米结构来实现多个无标记的超分辨显微成像，例如具有双曲线分布的超透镜微球，基于超材料的固体浸没透镜(mSIL)和纳米线环形照明显微镜(NWRIM)等。然而，上述技术也有一定的应用瓶颈。一方面，基于纳米结构的设备必须放置在物体的近场中，并且仅限于表面检测。另一方面，这些技术对制造过程提出了复杂的要求，并且还增加了成本。
[0003]一些无标记的远场光学显微镜技术被用于三维物体的表面形貌测量，它们的结构比SNOM更简单，其主要特点就是利用了光的干涉性质，如白光干涉仪。该技术利用不同波长的光在不同光程差时相干增强，而相干增强的波长对应的颜色就体现物体该点的光程信息，也是物体深度信息。虽然白光干涉仪可以实现高的轴向分辨率，但是它的横向分辨率并不高，是受限于衍射极限的。
[0004]共聚焦显微技术是一种能同时提高轴向分辨率和轴向分辨率的技术，而在共聚焦系统上改进的强度差分技术能近一步提高横向和轴向分辨率。强度差分技术有着易于实施且不限于样品的特定特性，并以更经济的方式提高显微镜的空间分辨率。早在20世纪90年代就有人提出了将宽场图像减去共聚焦图像能提高分辨率，同时反应物体深度信息。但这种方法在频谱上只是减弱了低频信息，放大高频信息，也因此减小了图像的信噪比，所以并没有得到很好的应用。
[0005]公开号为CN102830102A的专利申请描述的差动共聚焦显微技术(DCM)，通过利用双共焦装置的微分减法成功地提高了轴向分辨率。实现了纳米级的轴向检测，这有利于材料表面形貌的起伏检测。
[0006]公开号为CN110220875A的专利申请描述的荧光差分显微技术(FED)，通过两路不同激发光，实心光斑和空心光斑激发样品，并将实心光斑的图像减去空心光斑的图像，由于这种相减处理相当于减小点扩散函数，从而实现了横向超分辨。在后续的改进中，通过加入并行扫描装置，减少了扫描时间，实现实时成像。将FED方法应用在无标记显微技术中能有效地提高横向分辨率。

技术实现思路

[0007]本专利技术在激光点扫描显微术的基础上，融合横向并行辐射差分超分辨技术与差动共焦显微技术的各自特点，提供一种横向光学超分辨、轴向纳米级分辨的三维超分辨成像
系统，实现对无标记非荧光样品及材料的表面形貌检测。
[0008]通过差动共焦显微探测技术提高成像系统的轴向分辨率，通过并行辐射差分超分辨方法提高其横向分辨率。
[0009]这本专利技术的具体技术方案步骤如下：
[0010](1)利用实心照明光束和空心照明光束对无标记样品同时进行二维扫描，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦反射光强度图I
s
(x,y,z0,0)和由空心光斑调制得到的负共聚焦反射光强度图I
k
(x,y,z0,0)；
[0011](2)根据公式I
f
(x,y,z0,0)＝I
s
(x,y,z0,0)
‑
αI
k
(x,y,z0,0)得到横向超分辨图像I
f
(x,y,z0,0)，其中α为权重因子，可根据实际成像效果确定，在计算过程中，有可能因为差分出现负强度问题，则采用直接归零的方式；
[0012](3)采用差动测量扫描方法对样品进行扫描测量实现轴向超分辨，一个光电探测器置于焦平面的离焦距离
‑
u
M
处，另一个光电探测器置于焦平面的离焦距离+u
M
处，分别测得反映样品表面形貌变化大小的强度曲线I
A
(x,y,z,
‑
u
M
)和I
B
(x,y,z,+u
M
)，进行差动相减并进行归一化处理，后得到一个差分强度信号I
D
(x,y,z,u
M
)；
[0013](4)优化u
M
值，提高差动共焦方法的轴向分辨率，然后根据强度曲线I
D
(x,y,z,u
M
)在零点附近AB线性测量范围内的光强大小，重构出样品表面形貌和微观尺度。
[0014](5)通过结合横向超分辨图像信息和轴向差动测量信息得到三维超分辨显微图像。
[0015]本专利技术原理如下：
[0016]设(x,y,z)为样品物空间坐标，此方法得到的图像原始数据可记为I(x,y,z,u
M
)，其中u
M
是探测器的离焦距离。
[0017]为方便计算与分析，对各变量进行坐标变换：
[0018]径向光学坐标υ：a为光瞳半径，f为物镜焦距；极坐标下的径向坐标轴向光学坐标u：归一化半径J0为零阶贝塞尔函数。
[0019]记装置中的显微物镜的光瞳函数为P(ρ)，根据共聚焦理论，三维的点扩散函数表示为：
[0020][0021](1)横向超分辨的实现
[0022]用实心激发光斑和横向空心激发光斑两种激发模式的光斑扫描，分别得到两幅图像。两种激发模式探测器都在焦平面上，所以u
M
＝0。实心激发时，光瞳函数P
s
(ρ)＝1,|ρ|≤1，得到的是得到的普通共焦图像，强度分布记为I
s
(x,y,z,0)。横向空心激发时，激发光经过涡旋相位板，光瞳函数变为得到的负共焦图像，强度分布记为I
k
(x,y,z,0)。
[0023]横向超分辨图像I
f
(x,y,z,0)是共焦图像与负共焦图像的特殊权重差分的结果，表达式为：
[0024]I
f
(x,y,z,0)＝I
s
(x,y,z,0)
‑
αI
k
(x,y,z,0)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0025]式中，I
s
(x,y,z,0)和I
k
(x,y,z,0)在计算时均取归一化强度分布，α为权重因子，可根据实际成像效果确定。在计算过程中，有可能因为差分出现负强度问题，一般采取直接归零的方式。
[0026](2)纵向超分辨的实现
[0027]为了分析该系统中的纵向分辨率，以探测物体是一个理想点，探测器位于焦平面为例，并且只考虑探测到的中心点轴向分布的光强分布，即式(2)中的x＝0,y＝0,υ＝0,u
M
＝0：
[0028][002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，包括步骤：(1)利用实心照明光束和空心照明光束对无标记样品同时进行二维扫描，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦反射光强度图I
s
(x,y,z0,0)和由空心光斑调制得到的负共聚焦反射光强度图I
k
(x,y,z0,0)；(2)根据公式I
f
(x,y,z0,0)＝I
s
(x,y,z0,0)
‑
αI
k
(x,y,z0,0)得到横向超分辨图像I
f
(x,y,z0,0)，其中α为权重因子，(3)采用差动测量扫描方法对样品进行扫描测量实现轴向超分辨，一个光电探测器置于焦平面的离焦距离
‑
u
M
处，另一个光电探测器置于焦平面的离焦距离+u
M
处，分别测得反映样品表面形貌变化大小的强度曲线I
A
(x,y,z,
‑
u
M
)和I
B
(x,y,z,+u
M
)，进行差动相减并进行归一化处理，后得到一个差分强度信号I
D
(x,y,z,u
M
)；(4)优化u
M
值，根据强度曲线I
D
(x,y,z,u
M
)在零点附近AB线性测量范围内的光强大小，重构出样品表面形貌和微观尺度；(5)通过结合横向超分辨图像信息和轴向差动测量信息得到三维超分辨显微图像。2.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤(1)和(3)中，利用雪崩光电二极管(APD)或光电倍增管(PMT)收集反射的激光强度信号。3.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，张宇森，何敏菲，周国尊，刘旭，李海峰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：