空间邻近化学发光法检测D-二聚体的试剂盒的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种空间邻近化学发光法检测D

【技术实现步骤摘要】
空间邻近化学发光法检测D
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二聚体的试剂盒的应用
[0001]本申请是申请日为2018年09月25日、申请号为201811115058.5、专利技术名称为《空间邻近化学发光法检测D
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二聚体的试剂盒及其检测方法》的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种空间邻近化学发光法检测D
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二聚体的试剂盒的应用。

技术介绍

[0003]D
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二聚体(D
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Dimer)是交联纤维蛋白的降解产物，其形成机理为：纤维蛋白原在凝血酶的作用下，从α链及β链依次脱去多肽A和多肽B，形成纤维蛋白Ⅰ和纤维蛋白Ⅱ，纤维蛋白在因子XII的作用下交联在血管壁上，并被活化的纤溶酶裂解而产生各种FDP碎片。由于γ链的交联，便产生了包含γ链相连的2个D片段，即D
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二聚体，它的分子量约为18万道尔顿，体内半衰期为8h。
[0004]D
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二聚体是特异性反映体内继发性纤溶性亢进的标志物之一，多种疾病均可引起D
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二聚体的升高。研究资料表明：血浆中D
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二聚体的水平与心血管疾病密切相关，心血管疾病血浆D
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二聚体含量阳性率的高低依次为主动脉夹层、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛、先天性心脏病、心律失常，表明病情越危机，D
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二聚体上升幅度越大，阳性率越高。其中主动脉夹层阳性率达100％，D
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二聚体的检测对其具有非常好的阴性预期值，因此其对于主动脉夹层的排除诊断有较高的应用价值。
[0005]深静脉血栓(DVT)形成是肺栓塞的主要易患因素，大约51％～71％的肺栓塞的血栓栓子来源于DVT。DVT的发现虽不能直接诊断肺栓塞，但却能给予很大的提示。通过静脉造影、超声多普勒血管检查以及肢体阻抗容积图等检查有助于诊断DVT，而目前许多研究表明血浆D
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二聚体含量检测也是DVT筛查的一种有效手段。研究发现静脉造影证实为DVT的患者血浆D
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二聚体水平均升高，若采用以D
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二聚体>500ng/mL为阳性，则检查的敏感性和特异性分别为95％和77％，阴性预测值为92％。因此，临床上怀疑DVT患者若D
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二聚体检测结果正常，则有助于排除VT的诊断。
[0006]在抗凝及溶栓治疗方面，D
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二聚体还具有一定指导意义，可作为继发性纤溶亢进的标志，观察肝素抗凝效果及血栓溶解情况。溶栓治疗后，4～8h可见D
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二聚体水平明显增高，这与大量新鲜血栓溶解有直接关系，之后可见逐渐降低，并于24h～7d维持至正常水平。这说明此时的治疗并无明显效果，血栓大小变化不大，若出现降低后再次增高现象，则表明再次形成血栓，陈旧性血栓患者不会出现D
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二聚体水平上升现象，若异常增高则说明存在新的血栓形成。在脑梗死急性期溶栓治疗中，随着血栓溶解，血浆中D
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二聚体含量急剧上升，当血栓完全溶解，血管再通后，其含量迅速下降。如持续较高的水平不降，提示血栓未完全溶解或有继发性血栓形成，因而在脑梗死治疗，尤其在溶栓治疗中，动态检测D
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二聚体含量对脑梗死诊断、疗效观察及预后有重要临床意义。
[0007]D
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二聚体是交联纤维蛋白的特异性降解产物，是血栓形成和溶解的标志物。它的
生成和增高表明体内存在高凝状态，血栓形成和继发纤溶性增强。有文献报道：AMI的血栓形成率最高，SAP血栓发生率最低，UAP血栓形成率介于AMI和SAP之间。因此，测定D
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二聚体对于冠心病的临床分型有一定的参考价值。
[0008]目前临床上D
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Dimer含量的检测主要采用免疫比浊法、酶促化学发光法、非酶促化学发光法。免疫比浊法线性范围窄，灵敏度低，且受血脂类影响较大；酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)系统等，共同点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗；非酶促化学发光包括吖啶酯、草酸酯系统等，共同点为发光过程中标记物被消耗。不管酶促和非酶促化学发光，均需要固相载体(如微孔板或磁微粒)，且反应完成后均需要对反应复合物进行清洗，以去除未结合的游离成分。其操作复杂，影响因素多，从而造成检测结果不稳定，重复性不佳。

技术实现思路

[0009]针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种空间邻近化学发光法检测D
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二聚体的试剂盒的应用。该法作为一种真正意义上的均相化学发光技术，无需载体，没有包被、洗涤过程，试剂盒组分少，且灵敏度高、重复性好、操作简单。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：
[0011]第一方面，本专利技术提供一种D
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二聚体的检测试剂盒，试剂盒包括：酶标记物、发光标记物、辅助剂、触发剂和校准品；其中，酶标记物的原料组分包括过氧化物酶标记的DDimer检测抗体，发光标记物的原料组分包括9,10
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二氢吖啶标记的D
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Dimer捕获抗体。
[0012]优选地，酶标记物的原料组分还包括0.05M磷酸盐缓冲液；更优选地，制备方法包括：称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中，之后加入0.2mL新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min，将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；加20μL 0.2M pH 9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入1mg抗D
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Dimer单克隆抗体室温避光轻轻搅拌2h，加新配的4mg/mL硼氢化钠液，混匀，于4℃放置2h，将上述液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4 PBS透析，4℃过夜；取出透析物，加适量甘油置
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20℃冰箱保存。
[0013]优选地，发光标记物的原料组分还包括0.05M Tris缓冲液；更优选地，制备方法包括：发光底物Acridan用500μL的DMF溶解；吸取溶解的Acridan41.3μL，加入0.05M硼酸钠缓冲液708.7μL，再加入250μL抗D
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Dimer单克隆抗体，翻转混匀4～5次，在室温下静置30min；将标记反应管置于摇床上，在2～8℃下混合过夜，取出加入适量甘油置
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20℃冰箱保存。
[0014]优选地，辅助剂的组分包括发光辅助剂和pH 6.0枸橼酸盐缓冲液；更优选地，制备方法包括：称取枸橼酸1.82g，枸橼酸钠10.45g，加纯水溶解并定容至1000mL，在枸橼酸盐缓冲液中加入适量的发光辅助剂，混匀后分装，每瓶10mL置于4℃冰箱保存备用。
[0015]优选地，触发剂选用0.05M pH 8.0 Tris
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HCl缓冲液；更优选地，制备方法包括：称取Tris 6.06g，氯化钠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.D
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二聚体的检测试剂盒在空间邻近化学发光法检测D
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二聚体中的应用，其特征在于，所述D
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二聚体的检测试剂盒包括：酶标记物、发光标记物、辅助剂、触发剂和校准品；所述酶标记物的原料组分包括过氧化物酶标记的D
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Dimer检测抗体，所述发光标记物的原料组分包括9,10
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二氢吖啶标记的D
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Dimer捕获抗体；所述酶标记物的原料组分还包括0.05M磷酸盐缓冲液；所述酶标记物的制备方法包括：称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中，加入0.2mL新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min，将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；加入20μL 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入1mg抗D
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Dimer单克隆抗体室温避光轻轻搅拌2h，加新配的4mg/mL硼氢化钠液，混匀，于4℃放置2h，将上述液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4PBS透析，4℃过夜；取出透析物，加适量甘油后置于
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20℃冰箱保存；所述发光标记物的原料组分还包括0.05MTris缓冲液；所述发光标记物的制备方法包括：将发光底物Acridan用500μL的DMF溶解；吸取溶解的Acridan 41.3μL，加入0.05M硼酸钠缓冲液708.7μL，再加入250μL抗DDimer单克隆抗体，翻转混匀4～5次，室温静置...

【专利技术属性】
技术研发人员：奚伟红，朱丹丹，廖鸳鸯，
申请(专利权)人：无锡壹闪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：