一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品DNA的提取；(2)引物设计；(3)荧光PCR体系的构建；(4)特异性试验；(5)基因组灵敏度试验；(6)质量分数灵敏度试验。本发明专利技术引物特异性强，反应时间约为55分钟，大大节约了时间成本，龙利鱼基因组DNA灵敏度可达到10

【技术实现步骤摘要】
一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法。

技术介绍

[0002]龙利鱼俗称舌鳎鱼，属舌鳎科，舌鳎属(Cynogloddus)，是舌鳎属所有鱼类的俗称，是一种生活在中国近海大型底层暖温性鱼类。龙利鱼味道鲜美、营养丰富，属于高蛋白鱼类。但其自然资源量少，出肉率偏低。据报道,仅山东半岛海域分布的舌鳎属鱼类就有短吻红舌鳎(Cynoglossus joyneri)、长吻红舌鳎(C.lighti)、宽体舌鳎(C.robustus)、窄体舌鳎(C.gracilis)、半滑舌鳎(C.semilaevis)、紫斑舌鳎(C.purpureomaculatus)和短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)7种,均具有较高的经济价值。目前，在鱼类水产市场中，消费者对巴沙鱼和龙利鱼认知混淆，水产市场、餐饮行业将“巴沙鱼”冠名为“龙利鱼”进行销售，损害了消费者的合法权益。基于荧光PCR技术对于鱼肉真伪的鉴别，出台了对于石斑鱼等7种鱼类的检测标准方法，有学者通过荧光PCR法鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，国家市场监督管理总局于2019年发布了《鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS 201907》食品补充检验方法(2019年第9号),分别设计了鳕鱼及其制品中易混淆物种裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)、油鱼(异鳞蛇鲭Lepidocybium flavobrunneum、棘鳞蛇鲭Ruvettus pretiosus)和南极犬牙鱼(小鳞犬牙南极鱼Dissostichus eleginoides、鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawsoni)成分的实时荧光PCR检测方法的特异性引物和探针，可用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品的检测。但是应用荧光PCR技术对于龙利鱼源性成分进行检测的方法却未见报道。因此亟需一种高效准确的检测鱼肉制品中龙利鱼源性成分的方法。以DNA分子特异基因扩增技术为基础的实时荧光定量PCR(Real
‑
Time PCR)具有简单、快速、灵敏度高和准确性高的优点，目前已是肉制品物种源性成分鉴定普遍采用的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对现有的问题，提供了一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法。
[0004]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，包括如下步骤：
[0006](1)样品DNA的提取：
[0007]用无菌剪刀取样品25mg，捣碎成肉糜，置于DNA提取试剂盒提供的管中，按照DNA提取试剂盒的步骤进行操作；
[0008](2)引物设计：
[0009]a.选取了半滑舌鳎(C.semilaevis)，短吻红舌鳎(C.joyneri)，长吻红舌鳎(C.lighti)，宽体舌鳎(C.robustus)，窄体舌鳎(C.gracilis)，紫斑舌鳎
(C.purpureomaculatus)，短吻三线舌鳎(C.abbreviatus)，双线舌鳎(C.bilineatus)，中华舌鳎(C.sinicus)，褐斑三线舌鳎(C.trigrammus)，黑鳃舌鳎(C.roulei)，斑头舌鳎(C.puncticeps)，少鳞舌鳎(C.oligolepis)13种龙利鱼进行研究；
[0010]b.通过GenBank下载此13种龙利鱼，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，以及常见的肉类猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因序列，利用clustalx软件对此13种龙利鱼的16S rRNA基因序列进行比对，找出13种龙利鱼的相同序列，并且与巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因存在差异的序列，通过NCBI网站的引物设计工具Primer
‑
BLAST和探针设计软件Primer Express 3.0设计一组13种龙利鱼的通用引物和探针，分别为上游引物、下游引物和探针引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如系列表SEQ IDNO:2所示；探针引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；其核苷酸序列为：
[0011]上游引物F：5
’‑
AGACGAGAAGACCCTGTGGA
‑3’
；
[0012]下游引物R：5
’‑
ATTGCGCTGTTATCCCTGG
‑3’
；
[0013]探针序列P：5
’‑
(FAM)ATCTTCAGTTGGGGCGAC
‑3’
(MGB)；
[0014](3)荧光PCR体系的构建：
[0015]通过对引物浓度和循环数进行PCR反应程序的条件优化，确定了以下条件：
[0016]龙利鱼实时荧光PCR反应体系：10μL Premix Ex Taq
TM
，上下游引物、TaqMan探针各0.8μL(浓度为10μM)，提取DNA模板1μL，用灭菌水补足至总体积20μL；
[0017]PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃15s，60℃30s，40个循环；
[0018](4)特异性试验：
[0019]利用超微量分光光度计测定样品DNA在260nm和280nm处的吸光值A260和A280，当A260/A280比值在1.7
‑
1.9之间，适宜于PCR扩增，利用步骤(3)设计的荧光PCR体系，分别以半滑舌鳎，短吻红舌鳎，长吻红舌鳎，宽体舌鳎，窄体舌鳎，紫斑舌鳎，短吻三线舌鳎巴，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭动物的DNA为模板，利用超微量分光光度计测定上述样品DNA浓度，将DNA浓度稀释成1ng/μL，以纯水为模板作为空白对照，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性，并对半滑舌鳎样品的扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对；
[0020](5)基因组灵敏度试验：
[0021]按照步骤(1)的方法提取半滑舌鳎的DNA；利用超微量分光光度计测定半滑舌鳎样品DNA浓度，用超纯水10倍梯度稀释半滑舌鳎，半滑舌鳎DNA量选取1ng，10
‑1ng，10
‑2ng，10
‑3ng，10
‑4ng，以纯水为模板作为空白对照，以步骤(3)中的荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR；
[0022](6)质量分数灵敏度试验：
[0023]取巴沙鱼和半滑舌鳎样品，置于电热恒温鼓风干燥箱中，105℃烘干，匀浆仪打磨成干粉，将半滑舌鳎和巴沙鱼干粉按照干重质量比1:9混合，再置于匀浆仪中充分打磨混合，制成含有半滑舌鳎干粉10％，1％，0.1％的巴沙鱼粉；按照步骤(1)提取上述样品的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用实时荧光PCR手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品DNA的提取：用无菌剪刀取样品25mg，捣碎成肉糜，置于DNA提取试剂盒提供的管中，按照DNA提取试剂盒的步骤进行操作；(2)引物设计：a.选取了半滑舌鳎，短吻红舌鳎，长吻红舌鳎，宽体舌鳎，窄体舌鳎，紫斑舌鳎，短吻三线舌鳎，双线舌鳎，中华舌鳎，褐斑三线舌鳎，黑鳃舌鳎，斑头舌鳎，少鳞舌鳎13种龙利鱼进行研究；b.通过GenBank下载此13种龙利鱼，巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，以及常见的肉类猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因序列，利用clustalx软件对此13种龙利鱼的16S rRNA基因序列进行比对，找出13种龙利鱼的相同序列，并且与巴沙鱼，大西洋鳕鱼，太平洋鳕鱼，大西洋鲑鱼，鲷鱼，草鱼，鲤鱼，猪，牛，羊，鸡，鸭，鹅的16S rRNA基因存在差异的序列，通过NCBI网站的引物设计工具Primer
‑
BLAST和探针设计软件Primer Express 3.0设计一组13种龙利鱼的通用引物和探针，分别为上游引物、下游引物和探针引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO:1所示；下游引物序列如系列表SEQ ID NO:2所示；探针引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；其核苷酸序列为：上游引物F：5
’‑
AGACGAGAAGACCCTGTGGA
‑3’
；下游引物R：5
’‑
ATTGCGCTGTTATCCCTGG
‑3’
；探针序列P：5
’‑
(FAM)ATCTTCAGTTGGGGCGAC
‑3’
(MGB)；(3)荧光PCR体系的构建：通过对引物浓度和循环数进行PCR反应程序的条件优化，确定了以下条件：龙利鱼实时荧光PCR反应体系：10μL Premix Ex Taq
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【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，
申请(专利权)人：临沂市检验检测中心，
类型：发明
国别省市：