基于DNA靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法技术

一种基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，从实际样品中提取得到的双链基因组DNA解旋以获得单链的靶向基因片段，当反应体系中存在具有较强链置换活性的Bst DNA聚合酶时，在不同比例上下游引物的作用下，双链的基因组DNA会在反应原料脱氧核糖核苷三磷酸等存在的条件下解旋生成单链的靶向DNA；单链的靶基因片段作为目标模板序列，与相对应核酸序列的分子信标发生杂交反应，此时会由于荧光基团与淬灭基团之间距离的加大，产生荧光信号；将测量到的荧光强度换算为相对荧光比，根据

【技术实现步骤摘要】
基于DNA靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法


[0001]本专利技术属于食品检测
，尤其是涉及一种基于DNA靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法。

技术介绍

[0002]肉类和肉制品是发达国家和发展中国家人类的重要食物来源。肉类可以提供许多重要的营养物质，如蛋白质、脂肪、矿物质和维生素。虽然有各种国家和国际法律来监督肉类和肉制品的质量和安全，但肉类掺假仍然普遍存在。大多数肉类掺假是出于经济动机，如羊肉中低成本添加鸭肉，导致消费者遭受经济损失。少量掺假可能是由于加工过程中的偶然污染。肉类掺假都可能导致严重的公共健康风险。从农民到监管者，从生产者到消费者，肉类掺假已成为生产和分销过程中所有肉类产业链的一个问题。
[0003]食品掺假检测有不同的物理技术，包括微观和宏观视觉结构分析，以及分析食品的物理特性(如形态性状、质地、容重、溶解度等)。显微和宏观方法与化学图谱的结合同时提供了鉴定和鉴别。一些研究表明，这些方法可以用于检测不同食品的潜在欺骗，通过光学显微镜可以检测到产品的掺假。利用宏观和微观特征的视觉结构分析在作为掺假类型之一检测中非常有用。用于掺假检测的化学和生化技术，有各种方法可分为四组：色谱技术、光谱技术、免疫技术和电泳技术。一般来说，化学和/或生化技术与物理技术的区别在于它们更准确，可以在较低浓度下检测掺假/污染物。但它们的缺点是需要训练有素的人员，而且在工业适用性方面成本高昂。
[0004]在过去的二十年里，已经针对不同的标记建立或优化了肉类和肉制品的真实性检测技术，例如基于脱氧核糖核酸(DNAs)的聚合酶链反应(PCRs)、基于蛋白质的免疫学技术、基于特定代谢物的光谱技术等等，这些技术存在样品消耗量大，检测不准确等缺点。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题与不足，本专利技术提供一种基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，能准确检测出肉类中的成分，进而鉴定肉类掺假情况。
[0006]本专利技术提供的具体技术方案是：一种基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，包括将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤；以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤；将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤。
[0007]进一步地，所述将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤包括：
[0008]称取待测肉类样品并将其打碎处理成细胞悬液，置于10000r/min离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，充分振荡；
[0009]再加入20μL蛋白酶K溶液后置于56℃直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
[0010]再加入200μL缓冲液GB，充分混匀后置于70℃放置5min至溶液变清亮；加入200μL无水乙醇并充分振荡15s，然后将所有溶液转移至一个干净的吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中；
[0011]向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中。向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中，然后12000r/min离心2min，弃废液，并将吸附柱CB3置于室温放置2min以彻底晾干残余的漂洗液；
[0012]将吸附柱CB3转入另外一个干净的离心管，向吸附膜中间部位滴加适量TE缓冲液，放置2min～5min，12000r/min离心2min，所得溶液即为单链的靶向基因片段溶液。
[0013]进一步地，以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤包括：
[0014]将Isothermal Amplification缓冲液Ⅱ原液、MgSO
4 4mM、甜菜碱1M、dNTP0.2～1.0mM、上下游引物比例为1∶10、Bst DNA聚合酶2～20U和解链的单链靶向基因片段溶液，再加纯净水至溶液总体积为25uL；
[0015]再将所述溶液在65℃的恒温水浴锅中反应5min，然后升高温度至80℃反应5min，加入分子信标，在37℃、激发波长490nm以及发射波长521nm的条件下检测反应体系荧光强度的变化。
[0016]进一步地，所述将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤包括：
[0017]△
相对荧光比＝Fx/Fmax，其中Fx为所测肉类样品的荧光强度，Fmax为该组最强肉类样品荧光强度，根据
△
相对荧光比鉴定肉类组成成分。
[0018]进一步地，所述分子信标是5端修饰有FAM基团，3端修饰有DABCYL基团的功能分子。
[0019]进一步地，所述靶向基因片段来源于肉类样品的线粒体DNA。
[0020]进一步地，所述线粒体DNA线粒体D
‑
环区、细胞色素b(CytB)基因、细胞色素c氧化酶亚基I、II和III(COI，和COII)基因、ATPase亚基6和8(ATPase6和ATPase8)、12SrRNA和16SrRNA。
[0021]所述肉类样品包括：牛肉、猪肉、马肉、羊肉、鸡肉、鸭肉。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术提供的基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，包括将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤；以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤；将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤。该方法简单，敏感性和可靠性高，能准确检测出肉类中的成分，进而鉴定肉类掺假情况。
附图说明
[0024]附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0025]图1为荧光强度
‑
dNTP浓度变化图
[0026]图2为荧光强度
‑
Bst DNA浓度变化图
[0027]图3为鸡肉检测体系中的
△
相对荧光比
[0028]图4为牛肉检测体系中的
△
相对荧光比
[0029]图5为羊肉检测体系中的
△
相对荧光比
[0030]图6为猪肉检测体系中的
△
相对荧光比
[0031]图7为鸭肉检测体系中的
△
相对荧光比
[0032]图8为马肉检测体系中的
△
相对荧光比
具体实施方式
[0033]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，其特征在于，包括将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤；以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤；将测量到的荧光强度换算为相对荧光比的步骤。2.根据权利要求1所述的基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，其特征在于，所述将肉类样品双链基因组解旋以获得单链的靶向基因片段的步骤包括：称取待测肉类样品并将其打碎处理成细胞悬液，置于10000r/min离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，充分振荡；再加入20μL蛋白酶K溶液后置于56℃直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；再加入200μL缓冲液GB，充分混匀后置于70℃放置5min至溶液变清亮；加入200μL无水乙醇并充分振荡15s，然后将所有溶液转移至一个干净的吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中；向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中；向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中，然后12000r/min离心2min，弃废液，并将吸附柱CB3置于室温放置2min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入另外一个离心管，向吸附膜中间部位滴加适量TE缓冲液，放置2min～5min，12000r/min离心2min，所得溶液即为单链的靶向基因片段溶液。3.根据权利要求1所述的基于靶向基因片段鉴定肉类掺假成分的方法，其特征在于，以所述单链的靶向基因片段为目标模板序列，与相对应的分子信标发生杂交反应，产生荧光信号的步骤包括：将Isothe...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆茂林，冯永巍，黄丽俊，司竑飞，沈晓芳，
申请(专利权)人：无锡市食品安全检验检测中心江南大学，
类型：发明
国别省市：