一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用。所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I

【技术实现步骤摘要】
一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用


[0001]本专利技术涉及一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用，本专利技术属于基因工程


技术介绍

[0002]对基因组进行快速编辑改造具有十分重要的意义。同源重组是应用最广泛的基因编辑手段，基于该原理发展而来的内源性重组系统和λ
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Red重组系统已被广泛应用于微生物染色体的各种修饰，如沙门氏菌和大肠杆菌。内源性同源重组大多需要RecA蛋白参与，通常需要在负责打靶的自杀质粒中插入数百碱基甚至更长的同源序列。RecA介导的反应是一个费时费力的过程，而且重组效率很低。另外，RecA系统的重组功能总是处在激活状态，会导致意外重排的现象发生。经典λ
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Red重组系统包含来自于λ噬菌体的三种重要重组相关蛋白(统称为Red重组酶)：exo、beta和gam。Exo是一种核酸外切酶，可产生单链DNA，参与DNA链的入侵和同化反应。Beta是一种单链DNA退火蛋白，并促进互补ssDNA的复性，还可以促进链交换。Gam蛋白可以与RecBCD蛋白结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒，所述的质粒命名为pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I
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SceI核酸内切酶基因和含有筛选标记的打靶片段区，其中，所述的筛选标记的两侧均带有I
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SceI识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)。2.如权利要求1所述的同源重组系统，其特征在于，所述的筛选标记为抗生素抗性基因或其他符合目的的筛选标记。3.如权利要求1所述的同源重组系统，其特征在于，所述的筛选标记为氯霉素，所述的其他符合目的的筛选标记包括蔗糖、荧光蛋白。4.如权利要求3所述的同源重组系统，其特征在于，所述的pKID220质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.一种构建权利要求1
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4任一项所述的同源重组系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以pDC质粒为骨架，所述的pDC质粒携带的氯霉素抗性基因盒两侧有I
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SceI内切酶识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)，所述的pDC质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以pBV220质粒为模板，用pDCprpL
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F和pDCprpL
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R引物扩增得到1483bp的温控元件CIts857
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P
R
P
L
片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将该片段通过Nhe I位点克隆到pDC质粒中，得到重组质粒，命名为pDC
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CItsPRPL；引物序列如下：pDCprpL
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F：GAGTAAACTTGGTCTGACAGTCACATGTTCTTTCCTGCGTpDCprpL
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R：TTTCGGGGAAATGTGGCTAGCCCTCCTTAATTTTTAACCAA2)通过PCR的方式扩增或者合成出含有编码I
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SceI内切酶和Red重组酶的核酸片段，命名为I
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SceI
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Gam
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bet
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exo，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过NheⅠ位点将该I
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SceI
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Gam
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bet
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exo片段克隆到pDC
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CItsPRPL中，最终获得的重组质粒，命名为pKID220。6.权利要求1
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4任一项所述的同源重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：于申业，刘思国，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：