一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统及其应用。本发明专利技术的双质粒系统包含序列为SEQ ID NO：1的pFnCpfAb

【技术实现步骤摘要】
一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统及其应用


[0001]本专利技术涉及一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]鲍曼不动杆菌是一种极具危害的人类机会致病菌，能够引发一系列严重的感染性疾病，对人类健康造成重大威胁。近些年来，随着抗生素的广泛使用，多重耐药(multi
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drug resistant,MDR)、泛耐药(extensively
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drug resistant,XDR)甚至全耐药(pan
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drug resistant,PDR)的鲍曼不动杆菌菌株不断出现，由其造成的病人严重感染及死亡病例与日俱增，强调了耐药型鲍曼不动杆菌引发人类感染的严重性和开发新型治疗手段的重要性。
[0003]新型治疗手段的开发离不开筛选新的药物靶标，而药物靶标的筛选离不开便捷的基因组编辑操作。目前用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的方法主要包括非复制许可质粒法、外源重组酶法、CBE单碱基编辑法和CRISPR
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Cas9基因组编辑法。其中非复制许可质粒法和外源重组酶法属于传统遗传操作工具，具有操作较为复杂、实验周期较长、基因敲除效率不高、难以实现精确无痕基因组编辑等缺点；CBE单碱基编辑法可以将靶点编辑窗口中的胞嘧啶碱基(C)转变为胸腺嘧啶碱基(T)，但无法实现基因的删除和插入；CRISPR
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Cas9基因组编辑法虽然可以实现鲍曼不动杆菌的精确无痕基因组编辑，但受限于来自酿脓链球菌Cas9核酸酶自身的性质，该系统只能识别20bp靶点邻近3
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端序列为NGG(N代表A/T/G/C任一碱基)的PAM位点，限制了该系统在鲍曼不动杆菌基因组中的靶点选择范围。
[0004]2015年报道的CRISPR
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Cpf1系统是一种比CRISPR
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Cas9系统更新的基因组编辑工具，与CRISPR
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Cas9系统工作原理类似，但具有一些独有的特点。CRISPR
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Cpf1系统由Cpf1核酸酶和crRNA两部分组成。其中crRNA长度仅为42
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44个核苷酸，更有利于多基因编辑。Cpf1核酸酶识别的PAM位点为邻近靶点5
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端富含胸腺嘧啶碱基(T)的序列，且可识别的靶点长度可变，这与CRISPR
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Cas9系统相比能够极大拓展靶点的选择范围。目前主要使用的CRISPR
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Cpf1工具有三种来源，分别来自新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)U112菌株、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6菌株和毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006菌株，其中来自新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)U112菌株的Cpf1核酸酶(以下简称FnCpf1)具有最广的PAM位点识别范围，能够有效提升该系统在目标基因组中的靶点选择范围。
[0005]CRISPR
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Cpf1系统已经在多种真核和原核生物中实现了高效率的基因组编辑，如哺乳动物细胞、玉米、小麦、酵母和谷氨酸棒杆菌等。然而，现有的CRISPR
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Cpf1工具具有较大局限性，尚不能直接应用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是：现有的CRISPR
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Cpf1工具具有较大局限性，尚不能直接应用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统，包含序
列为SEQ ID NO：1的pFnCpfAb
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apr质粒和序列为SEQ ID NO：2的pCrAb
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km质粒，所述pFnCpfAb
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apr质粒能够表达FnCpf1核酸酶和RecAb重组酶，所述pCrAb
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km质粒能够表达crRNA。
[0008]优选地，所述pFnCpfAb
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apr质粒包含FnCpf1基因片段、RecAb重组酶系统、lacI半乳糖诱导型启动子阻遏蛋白和革兰氏阴性菌管宿主复制子RSF1010；所述pCrAb
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km质粒包含基因crRNA、具有自切割活性的核酶HDV、用于后续插入靶点序列的位点BsaI_spacer、大肠杆菌质粒复制子rep和鲍曼不动杆菌质粒复制子WH1266\origin。
[0009]优选地，所述pFnCpfAb
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apr质粒和pCrAb
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km质粒均包含蔗糖敏感筛选标记基因sacB。
[0010]本专利技术还提供了上述pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因组编辑的应用。
[0011]优选地，所述应用包括在制备基因组编辑工具和/或基因组编辑试剂盒中的应用。
[0012]优选地，所述的基因组编辑包括敲除uspA基因。
[0013]优选地，所述的基因组编辑的PAM位点的序列为TTN序列和/或CTV序列，所述TTN序列中的N为任一碱基，所述CTV序列中的V为除碱基T之外的任一碱基，所述的基因组编辑的靶点序列长度为19
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25nt。
[0014]本专利技术还提供了一种细胞，包含上述pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统中的任一质粒或两种质粒。
[0015]本专利技术还提供了一种菌株，包含上述pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统中的任一质粒或两种质粒。
[0016]优选地，所述菌株为大肠杆菌TOP10菌株，所述的大肠杆菌TOP10菌株包含pFnCpfAb
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apr质粒和pCrAb
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km质粒，其保藏编号为：CCTCC M 2021056。
[0017]本专利技术的含有pFnCpfAb
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apr质粒和pCrAb
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km质粒的大肠杆菌TOP10菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli TOP10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2021年1月14日，保藏号为：CCTCC M 2021056。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0019]1.本专利技术通过分子生物学操作，对现有的CRISPR
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Cpf1系统进行探索和改造，构建的pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统能够适用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑，极大地扩展了鲍曼不动杆菌基因组编辑位点的选择范围，从而能够促进药物靶标的筛选和新药研发的加快。
[0020]2.本专利技术的pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统在鲍曼不动杆菌中能够高效识别TTN(N代表T/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统，其特征在于，包含序列为SEQ ID NO：1的pFnCpfAb
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apr质粒和序列为SEQ ID NO：2的pCrAb
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km质粒，所述pFnCpfAb
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apr质粒能够表达FnCpf1核酸酶和RecAb重组酶，所述pCrAb
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km质粒能够表达crRNA。2.如权利要求1的所述的pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统，其特征在于，所述pFnCpfAb
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apr质粒包含FnCpf1基因片段、RecAb重组酶表达基因、lacI半乳糖诱导型启动子阻遏蛋白和革兰氏阴性菌管宿主复制子RSF1010；所述pCrAb
‑
km质粒包含crRNA基因片段、具有自切割活性的核酶HDV、用于后续插入靶点序列的位点BsaI_spacer、大肠杆菌质粒复制子rep和鲍曼不动杆菌质粒复制子WH1266\origin。3.如权利要求1的所述的pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统，其特征在于，所述pFnCpfAb
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apr质粒和pCrAb
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km质粒均包含蔗糖敏感筛选标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇，丁玥，孔令保，荣华，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：