一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法技术

本发明专利技术公开了一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法，包括以下步骤：将纤维连接蛋白或明胶加入缓冲液中，在不低于37℃下搅拌均匀，得到混合液体；所述纤维连接蛋白或明胶在混合液体中的浓度为50

【技术实现步骤摘要】
一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法


[0001]本专利技术涉及医用生物材料
，尤其是一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法。

技术介绍

[0002]细胞外基质(ECM)是由结构功能蛋白、糖蛋白和蛋白多糖组成的复杂混合物，它们排列在一个独特的、组织特异性的三维超微结构中。这些蛋白具有许多功能，例如其能提供结构支持、张力强度和细胞表面受体的附着位点，以及作为信号因子的储存库，这些信号因子调节不同的宿主过程，如血管生成、细胞迁移、细胞增殖、炎症反应、免疫反应和伤口愈合。换言之，ECM是所有组织和器官的重要、动态、不可或缺的组成部分，是自然界中组织和器官形态发生、维持和损伤后重建的天然支架。在临床前和人类临床研究中，ECM已被用作许多不同组织类型重建的生物支架。
[0003]至今为止，市场上应用的脱细胞提取ECM的方法主要为化学方法(酸、碱、非离子型去污剂、磷酸三丁酯等处理)与生物方法(酶、螯合剂和毒素等)。目前，现有技术中的ECM提取技术，都存在着如下几个方面的问题：
[0004]第一，脱除的细胞无法回收：上文所述的脱细胞方法大都采用不同的技术将细胞破坏再联合其他方法洗脱细胞和细胞内的残余成分，这就导致对于一些珍贵的细胞而言，无法使用上述方法来得到ECM。
[0005]第二，残留试剂的不良后果：上文所述的脱细胞方法中包含了很大一部分生物化学试剂的应用，这些试剂在破坏细胞结构方面拥有强效的作用。但是，如果生物化学试剂在ECM中残留浓度较高，则会导致在移植入体内的过程中对宿主细胞产生较强的毒性作用，并且一些化学试剂也会对ECM的物化性质产生影响；
[0006]第三，操作复杂或成本较高，其所需的材料较多，工艺较为复杂。
[0007]因此，急需要提出一种工艺简单、提取可靠的从细胞层中提取细胞外基质层的方法。

技术实现思路

[0008]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法，本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法，包括以下步骤：
[0010]将纤维连接蛋白或明胶加入缓冲液中，在不低于37℃下搅拌均匀，得到混合液体；所述纤维连接蛋白或明胶在混合液体中的浓度为50
‑
200mg/mL；
[0011]采用膜式过滤器过滤所述混合液体，并将过滤后的混合液体置于模具内；
[0012]在低于25℃下冷冻，直至溶液凝胶化，得到溶液凝固形成凝胶；
[0013]将凝胶从模具内取出，并盖在培养有细胞的盖玻片上方，并按压凝胶使凝胶与细胞充分接触；
[0014]撕下凝胶，并采用37℃的缓冲液冲洗盖玻片，得到基底的细胞外基质。
[0015]优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
[0016]进一步地，所述缓冲液的浓度为50
‑
250mM。
[0017]优选地，所述缓冲液的PH值为6
‑
8。
[0018]优选地，所述膜式过滤器的过滤孔径为0.22μm或0.45μm。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020](1)本专利技术采用具有溶胶
‑
凝胶性质的温敏凝胶作为粘附细胞的支持材料，利用凝胶状态粘附细胞，并利用凝胶在较高温度下溶解的性质，通过物理张力与特异性黏附将细胞从基底与ECM层上粘附，既实现了对ECM的提取，又实现了对细胞的回收和再利用；
[0021](2)本专利技术采用溶胶
‑
凝胶性质的温敏凝胶(主要为纤维连接蛋白或明胶凝胶)作为原料制备凝胶，并将其作为粘细胞的媒介来提取ECM，其成本低廉、工艺简单。并且本专利技术是通过物理的方法脱去细胞，没有加入任何有害生物化学试剂，免去了后期对残留试剂的再去除，避免了因其在ECM中吸附残留浓度较高，而导致的在移植入体内的过程中对宿主细胞产生的较强毒副作用；
[0022](3)本专利技术采用纤维连接蛋白或明胶作为原料，利用纤维连接蛋白或明胶凝胶的张力以及丰富的整合素配体以及其在较高温度熔融较低温度凝固的性质，在较低温度下将其与细胞紧密接触，利用张力与特异性黏附粘让细胞从界面脱除，接下来在37度下溶解凝胶，便可回收细胞继续培养，有利于对较为珍贵细胞的ECM的提取；
[0023](4)本专利技术采用凝胶物理脱去细胞提取得到的ECM，作为自然界中组织和器官形态发生、维持和损伤后重建的天然支架，相比于人工合成的支架材料有更接近原有组织形态和内部微观结构的特点，所以ECM构成的生物支架材料具有更好的功能重建作用，更易于实现血管和神经组织的再生及组织生物学功能的再造，更易于细胞或细胞因子的再植入并发挥更好的作用；
[0024]综上所述，本专利技术具有工艺简单、提取可靠、成本低廉、重复利用等优点，在医用生物材料
具有很高的实用价值和推广价值。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需使用的附图作简单介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对保护范围的限定，对于本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0026]图1为本专利技术的提取流程图。
[0027]图2为本专利技术的粘细胞前后盖玻片的显微图样。
[0028]图3为本专利技术在脱细胞后的玻片上和空白玻片上细胞生长状态的荧光染色图。
具体实施方式
[0029]为使本申请的目的、技术方案和优点更为清楚，下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明，本专利技术的实施方式包括但不限于下列实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请
保护的范围。
[0030]实施例1
[0031]如图1至图3所示，本实施例提供了一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法，其包括以下步骤：
[0032]步骤一：配制100mM的PBS(磷酸盐)缓冲溶液，并用NaOH溶液或1M 的NaOH溶液调节PBS(磷酸盐)缓冲溶液的pH至6
‑
7；
[0033]步骤二：加入明胶或纤维连接蛋白，使混合溶液中明胶或纤维连接蛋白的质量浓度为150mg/mL，搅拌均匀；
[0034]步骤三：将混合溶液使用0.45μm膜式过滤器过滤后倒入直径35mm的培养皿中，后在4℃冰箱冷却15min；
[0035]步骤四：将凝胶从培养皿中取出后盖在培养有细胞的盖玻片上方，轻轻按压使凝胶与细胞充分接触；
[0036]步骤五：撕下凝胶，后用37度缓冲液清洗后得到ECM。
[0037]实施例2：
[0038]如图1至图3所示，本实施例提供了一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法，其包括以下步骤：
[0039]步骤一：配制A、B、C三种溶液，A溶液在37℃下混合90mg纤维蛋白原和3ml生理盐水，B溶液将凝血酶S(500U ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从细胞层中提取细胞外基质层的方法，其特征在于，包括以下步骤：将纤维连接蛋白或明胶加入缓冲液中，在不低于37℃下搅拌均匀，得到混合液体；所述纤维连接蛋白或明胶在混合液体中的浓度为50
‑
200mg/mL；采用膜式过滤器过滤所述混合液体，并将过滤后的混合液体置于模具内；在低于25℃冷冻，直至溶液凝胶化，得到溶液凝固形成凝胶；将凝胶从模具内取出，并盖在培养有细胞的盖玻片上方，并按压凝胶使凝胶与细胞充分接触；撕下凝胶，并采用37℃的缓冲液冲洗盖玻片，得到基底的细胞外基质。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏强，董翔宇，李洁，张曼，
申请(专利权)人：成都微沃科技有限公司，
类型：发明
国别省市：